基于NLRP3炎癥小體探討葛根素對(duì)缺氧致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞焦亡的影響

張曉丹 李文娣 張茹 盛潔靜 張佳男 劉慧宇 李松林

摘 要 目的：探討葛根素（Pue）對(duì)缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）焦亡的影響及其調(diào)控機(jī)制。方法：以大鼠PASMCs為對(duì)象，將其隨機(jī)分為常氧組、缺氧組和缺氧+Pue組（0.2 mmol/L），除常氧組外，其余各組均于37 ℃、5%CO2、3%O2條件下培養(yǎng)24 h以建立缺氧模型。采用Western blot法檢測細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白[NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1、白細(xì)胞介素1β、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白]的表達(dá)水平;采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中LDH的釋放量;采用Hoechst 33342/PI雙染色法檢測焦亡陽性細(xì)胞比例。另將PASMCs隨機(jī)分為常氧+對(duì)照質(zhì)粒組、缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組、缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組和缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒+Pue組，除常氧+對(duì)照質(zhì)粒組外，其余各組均同法建立缺氧模型;在分別轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)?；騈LRP3過表達(dá)質(zhì)粒后，采用Western blot法、LDH釋放實(shí)驗(yàn)和Hoechst 33342/PI雙染色法檢測Pue是否通過干擾NLRP3炎癥小體來發(fā)揮對(duì)缺氧致PASMCs焦亡的影響。結(jié)果：與常氧組比較，缺氧組細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平、LDH釋放量和焦亡陽性細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;而Pue可逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)（P<0.05或P<0.01）。當(dāng)NLRP3炎癥小體過表達(dá)時(shí)，細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平、LDH釋放量和焦亡陽性細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;且Pue可通過調(diào)控NLRP3炎癥小體而抑制上述現(xiàn)象（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：Pue可通過下調(diào)焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、減少LDH的釋放、降低焦亡陽性細(xì)胞比例，從而發(fā)揮對(duì)缺氧致PASMCs焦亡的抑制作用，其機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥小體的活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 葛根素;肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞;焦亡;NOD樣受體蛋白3炎癥小體

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the effects and mechanism of puerarin （Pue） on hypoxia-induced pyroptosis of pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs）. METHODS： PASMCs of rats as research objects were randomly divided into normoxia group， hypoxia group and hypoxia+Pue group （0.2 mmol/L）. Except for normoxia group， other groups were cultured with 5% CO2 and 3% O2 at 37 ℃ for 24 hours to establish hypoxia model. Western blot assay was used to detect the expression of pyroptosis related proteins [NOD-like receptor protein-3 （NLPR3）， caspase-1， interleukin-1β （IL-1β）， apoptosis-associated speck-like protein （ASC）]. Lactate dehydrogenase （LDH） release assay was used to detect the release of LDH in cells; Hoechst 33342/PI double staining test was adopted to detect the proportion of pyroptosis positive cells. PASMCs was randomly divided into normoxia group+control plasmid group， hypoxia+control plasmid group， hypoxia+over-expression plasmid group and hypoxia+over-expression plasmid+Pue group. Except for the normoxia+control plasmid group， the other groups were established hypoxia model by the same method. After transfection of control plasmid or NLRP3 over-expression plasmid， Western blot， LDH release test and Hoechst 33342/PI double staining test were used to investigate whether Pue could inhibit hypoxia-induced PASMCs pyroptosis by interfering with the activity of NLRP3 inflammasomes. RESULTS： Compared with normoxia group， the expression of pyroptosis related proteins， the release of LDH and the proportion of pyroptosis positive cells were increased significantly in? hypoxia group （P<0.05 or P<0.01）. Pue had the effect of reversing the above indexes （P<0.05 or P<0.01）. When the NLRP3 inflammasome was over-expressed， the expression of pyroptosis related proteins， the release of LDH and the proportion of pyroptosis positive cells were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Pue could inhibit the above phenomenon through regulating NLRP3 inflammasome （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Pue can significantly inhibit the hypoxia-induced pyroptosis of PASMCs by down-regulating the expression of pyroptosis related proteins， reducing the release of LDH and proportion of pyroptosis positive cells. The mechanism is related to the activity inhibition of NLRP3 inflammasome.

KEYWORDS? ?Puerarin; Pulmonary artery smooth muscle cells; Pyroptosis; NLRP3 inflammasome

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是一種以肺血管壁增厚為主要特征的心肺疾病[1-2]。自從Tuder等[3]學(xué)者首次在PAH患者的肺血管周圍發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤后，越來越多的學(xué)者證實(shí)了炎癥與PAH密切相關(guān)[4-6]。目前，炎癥已經(jīng)作為一項(xiàng)新的指標(biāo)用來評(píng)價(jià)患者PAH的嚴(yán)重程度，因此抑制炎癥反應(yīng)是緩解PAH癥狀、減少肺血管重構(gòu)的有效途徑[7-8]。在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用的NOD樣受體蛋白3（NLPR3）炎癥小體，是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和胱天蛋白酶1前體（pro-caspase-1）組成[9]。當(dāng)NLRP3炎癥小體活化時(shí)，pro-caspase-1會(huì)生成具有活性的胱天蛋白酶1（caspase-1），釋放白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和IL-18[10-11]。當(dāng)PAH發(fā)生時(shí)，上述炎癥因子會(huì)促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的遷移和增殖，使管腔變窄，從而加速PAH的進(jìn)展[12]。此外，最新研究表明，缺氧誘導(dǎo)的PASMCs中有異常細(xì)胞焦亡的存在，但具體的機(jī)制尚未闡明[13]?？梢?，從抗炎角度出發(fā)關(guān)注PAH與細(xì)胞焦亡之間的關(guān)系十分重要。

葛根素（Pue）是從中藥野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根中提取出的活性成分，其自分離鑒定起就引起了中外學(xué)者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代藥理研究表明，Pue可通過調(diào)節(jié)多種與炎癥疾病相關(guān)的炎性細(xì)胞、炎癥因子及其復(fù)雜的信號(hào)通路來發(fā)揮抗炎作用[14-15]。因此，筆者推測Pue可能通過焦亡相關(guān)信號(hào)通路來發(fā)揮保護(hù)PASMCs的作用，但該化合物對(duì)上述通路的調(diào)控作用以及具體機(jī)制尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mmol/L的Pue作用24 h即可通過自噬抑制PASMCs的增殖[16]。而在PAH中，細(xì)胞焦亡釋放出的炎癥因子最終也會(huì)導(dǎo)致PASMCs增殖[13]?；诖?，本文以PASMCs為研究對(duì)象，探討Pue（0.2 mmol/L）對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PASMCs焦亡的影響，并擬驗(yàn)證這種影響是否與NLRP3炎癥小體有關(guān)，以期為闡明Pue對(duì)PAH的影響提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括DYY6B型電泳及轉(zhuǎn)膜裝置、Gel Doc XR+型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），IX71型熒光顯微鏡（日本Olympus公司），HF100型三氣培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），BB150 CO2型細(xì)胞培養(yǎng)箱、MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher? ? Scientific公司），3K15型低溫高速離心機(jī)（德國Sigma公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

葛根素對(duì)照品（批號(hào)J1003A5，純度>98%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑配制成200 mmol/L的無菌溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

DMEM培養(yǎng)液（批號(hào)AF29498408）購自美國HyClone公司;胎牛血清（批號(hào)FB25015）購自美國Clark Bioscience公司;胰酶消化液、青-鏈霉素雙抗、RIPA細(xì)胞裂解液、Hoechst 33342/PI雙染檢測試劑盒（批號(hào)C0201、C0222、P0013B、C1056）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗大鼠ASC多克隆抗體、兔抗大鼠caspase-1多克隆抗體（批號(hào)分別為PA5-85810、PA5-87536）均購自美國CST公司;兔抗大鼠NLRP3單克隆抗體、小鼠抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)分別為ab263899、ab8226）均購自英國Abcam公司;兔抗大鼠IL-1β多克隆抗體（批號(hào)bs-20448R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗（批號(hào)分別為E030120、E030110）均購自美國EarthOx LLC公司;對(duì)照質(zhì)粒、NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒（批號(hào)均為00043118）均購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司;乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液（批號(hào)分別為MAK066、WBULS0100）均購自美國Sigma-Aldrich公司;X-treme轉(zhuǎn)染載體（批號(hào)65453）購自瑞士Roche公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)23227）購自美國Thermo Fisher Scientific公司;脫脂奶粉、DMSO（批號(hào)分別為1172、1084）購自德國Biofroxx公司;其余試劑為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為SPF級(jí)成年雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量（230±20） g，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（吉）2018-0007。所有動(dòng)物均在溫度（22±2） ℃、相對(duì)濕度（50±10）%的條件下飼養(yǎng)。本研究方案取得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 PASMCs的分離與體外培養(yǎng)

取大鼠3只，經(jīng)常規(guī)麻醉后，轉(zhuǎn)至無菌操作臺(tái)上。打開其胸腔，取出完整的肺，分離遠(yuǎn)端血管動(dòng)脈并除去外膜后剪成小塊，用胰酶消化后以3 000 r/min離心5 min。收集細(xì)胞沉淀，加入含有20%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混勻后培養(yǎng)，傳至第2代后用于后續(xù)研究。

2.2 Pue對(duì)缺氧PASMCs中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期PASMCs，按3×108 mL-1的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶3 mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)常氧組、缺氧組和缺氧+Pue組（Pue終濃度為0.2 mmol/L，參考文獻(xiàn)[15]并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)復(fù)孔6個(gè)。常氧組和缺氧組細(xì)胞加入等體積DMSO（體積分?jǐn)?shù)為0.1%），缺氧+Pue組細(xì)胞按1 μL/mL加入相應(yīng)藥液（Pue終濃度為0.2 mmol/L）。隨后，常氧組細(xì)胞于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，其余各組細(xì)胞均于37 ℃、5%CO2、3%O2條件下培養(yǎng)24 h以建立缺氧模型。取出細(xì)胞，用pH 7.3的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后勻漿，加入細(xì)胞裂解液適量，于冰上裂解;刮取細(xì)胞，收集裂解后的細(xì)胞液，于4 ℃下以13 500 r/min離心20 min;取上清液，采用BCA法測定蛋白含量后，于100 ℃下加熱變性5 min。取變性后蛋白樣品適量，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V），隨后以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再以10%脫脂奶粉室溫封閉1 h;然后分別加入NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC、β-actin一抗（稀釋比例分別為1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 500、1 ∶ 2 000），4 ℃孵育過夜;次日用TBST溶液洗膜，加入相應(yīng)二抗（NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC一抗加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，稀釋比例分別為1 ∶ 4 000、1 ∶ 6 000、1 ∶ 8 000、? ?1 ∶ 8 000;β-actin一抗加入HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗，稀釋比例為1 ∶ 4 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液洗膜，以ECL發(fā)光顯影后，置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。使用Quantity One 6.0軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參條帶的灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.3 Pue對(duì)缺氧PASMCs中LDH釋放的影響考察

采用LDH釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期PASMCs，按1×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔150 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，每組設(shè)置復(fù)孔6個(gè)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度并計(jì)算細(xì)胞中LDH的釋放量：LDH釋放量（%）=（樣品吸光度-對(duì)照孔吸光度）/（細(xì)胞最大酶活性的吸光度-對(duì)照孔吸光度）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.4 Pue對(duì)缺氧PASMCs中焦亡陽性細(xì)胞比例的影響考察

采用Hoechst 33342/PI雙染法進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期PASMCs，按2×104 mL-1的密度接種于24孔板中，每孔300 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，每組設(shè)置復(fù)孔6個(gè)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行染色處理后在熒光顯微鏡下觀察，用Image J 6.0軟件處理分析并計(jì)算焦亡陽性細(xì)胞比例：焦亡陽性細(xì)胞比例=焦亡陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%（Hoechst 33342染料可將活細(xì)胞的細(xì)胞核染成藍(lán)色，而PI染料只能將細(xì)胞膜破裂的焦亡細(xì)胞的細(xì)胞核染成紅色）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.5 NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建合格性考察

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期PASMCs，按3×108 mL-1的密度接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶3 mL。試驗(yàn)設(shè)常氧+對(duì)照質(zhì)粒組和常氧+過表達(dá)質(zhì)粒組，每組設(shè)置復(fù)孔6個(gè)。細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)70%時(shí)，以X-treme為轉(zhuǎn)染載體對(duì)常氧+過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染：首先，棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)液，將DMEM培養(yǎng)液（100 μL）分別與X-treme（7.5 μL）、對(duì)照質(zhì)粒（3 mg）、NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒（3 mg）混合5 min;然后，再將含X-treme的DMEM培養(yǎng)液分別與含對(duì)照質(zhì)粒和NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒的DMEM培養(yǎng)液混合15 min;最后，加至含有DMEM培養(yǎng)液2.8 mL的培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)染6 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，加入“2.1”項(xiàng)下含血清、青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液適量。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取出，按“2.2”項(xiàng)下Western blot實(shí)驗(yàn)操作檢測細(xì)胞中NLRP3蛋白的表達(dá)水平，并以P<0.05（常氧+過表達(dá)質(zhì)粒組與常氧+對(duì)照質(zhì)粒組相比）表示此過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建合格。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.6 NLRP3炎癥小體過表達(dá)時(shí)Pue對(duì)缺氧PASMCs中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期PASMCs，設(shè)常氧+對(duì)照質(zhì)粒組、缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組、缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組、缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒+Pue組，每組設(shè)置復(fù)孔6個(gè)。細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法接種、造模、給藥，按“2.5”項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h后，再按“2.2”項(xiàng)下Wes- tern blot實(shí)驗(yàn)操作檢測細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.7 NLRP3炎癥小體過表達(dá)時(shí)Pue對(duì)缺氧PASMCs中LDH釋放的影響考察

采用LDH釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期PASMCs，按“2.3”項(xiàng)下方法接種，按“2.6”項(xiàng)下方法分組，再按“2.2”項(xiàng)下方法造模、給藥，每組設(shè)置復(fù)孔6個(gè)。細(xì)胞按“2.5”項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h后，再按“2.3”項(xiàng)下方法檢測和計(jì)算細(xì)胞中LDH釋放量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.8 NLRP3炎癥小體過表達(dá)時(shí)Pue對(duì)PASMCs中焦亡陽性細(xì)胞比例的影響考察

采用Hoechst 33342/PI雙染法進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期PASMCs，按“2.4”項(xiàng)下方法接種，按“2.6”項(xiàng)下方法分組，再按“2.2”項(xiàng)下方法造模、給藥，每組設(shè)置復(fù)孔6個(gè)。細(xì)胞按“2.5”項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h后，再按“2.4”項(xiàng)下方法檢測焦亡陽性細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Pue對(duì)缺氧PASMCs中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與常氧組比較，缺氧組細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與缺氧組比較，缺氧+Pue組細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表1。

3.2 Pue對(duì)缺氧PASMCs中LDH釋放量的影響

與常氧組比較，缺氧組細(xì)胞中LDH的釋放量顯著升高（P<0.01）;與缺氧組比較，缺氧+Pue組細(xì)胞中LDH的釋放量顯著降低（P<0.01），詳見表2。

3.3 Pue對(duì)缺氧PASMCs中焦亡陽性細(xì)胞比例的影響

與常氧組比較，缺氧組細(xì)胞紅色熒光增強(qiáng)，其焦亡陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01）;與缺氧組比較，缺氧+Pue組細(xì)胞紅色熒光減弱，其焦亡陽性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），詳見圖2、表2（圖2中，Hosechst 33342表示視野內(nèi)所有能被染色的活細(xì)胞圖，PI表示發(fā)生焦亡的細(xì)胞圖，Merge為兩者合并圖，下同）。

3.4 NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的合格性

常氧+過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞中NLRP3蛋白的表達(dá)水平顯著高于常氧+對(duì)照質(zhì)粒組[（1.79±0.45） vs. （1.21±0.14），P<0.05]，提示此NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用作后續(xù)研究，詳見圖3。

3.5 NLRP3過表達(dá)時(shí)Pue對(duì)缺氧PASMCs中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC表達(dá)水平的影響

與常氧+對(duì)照質(zhì)粒組比較，缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞中NLPR3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組比較，缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞中上述4種蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組比較，缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒+Pue組細(xì)胞中上述4種蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表3。

3.6 NLRP3過表達(dá)時(shí)Pue對(duì)缺氧PASMCs中LDH釋放量的影響

與常氧+對(duì)照質(zhì)粒組比較，缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞中LDH的釋放量顯著升高（P<0.01）;與缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組比較，缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞中LDH的釋放量顯著升高（P<0.05）;與缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組比較，缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒+Pue組細(xì)胞中LDH的釋放量顯著降低（P<0.05），詳見表4。

3.7 NLRP3過表達(dá)時(shí)Pue對(duì)缺氧PASMCs中焦亡陽性細(xì)胞比例的影響

與常氧+對(duì)照質(zhì)粒組比較，缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞中多見紅色熒光，其焦亡陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01）;與缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組比較，缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞中紅色熒光有所增強(qiáng)，其焦亡陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）;與缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒組比較，缺氧+過表達(dá)質(zhì)粒+Pue組細(xì)胞中的紅色熒光有所減少，其焦亡陽性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），詳見圖5、表4。

4 討論

在PAH中，炎癥反應(yīng)是其關(guān)鍵的致病因素：在正常情況下，免疫炎癥的發(fā)生有利于病原體的清除;但在PAH中，炎性細(xì)胞釋放出的炎癥因子會(huì)促進(jìn)PASMCs的增殖和肺血管的異常收縮，進(jìn)而加速肺血管的重構(gòu)[17]。無論是在體外培養(yǎng)的PASMCs還是在缺氧或野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型中，均有研究證實(shí)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核因子κB（NF-κB）、IL-6、IL-1β、IL-18等炎癥因子的存在[18-20];同時(shí)，本課題組早期研究中也發(fā)現(xiàn)，PAH模型大鼠體內(nèi)細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子1表達(dá)增加，炎癥反應(yīng)和PAH進(jìn)程加劇[21]?？梢?，炎癥因子在PAH中的作用不容忽視。

隨著細(xì)胞焦亡相關(guān)研究的開展，已有學(xué)者開始關(guān)注這種促炎形式的細(xì)胞程序性死亡與PAH之間的關(guān)系[22-23]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)先形成直徑10～20 nm的孔道，迫使鉀離子外流，使得細(xì)胞因吸水過多而發(fā)生物理破裂，最終導(dǎo)致胞內(nèi)LDH和炎癥因子的滲出;同時(shí)，當(dāng)細(xì)胞膜的完整性被破壞時(shí)，Hoechest33342/PI等熒光染料就可以嵌入這些細(xì)胞的雙鏈DNA中，使焦亡陽性被染色[24-25]。正常生理狀態(tài)下，焦亡可使機(jī)體免受異常損傷和炎癥刺激;而其異常活躍則會(huì)導(dǎo)致病理性炎癥的發(fā)生[26]。Zhang等[16]的研究表明，由缺氧激活的程序性死亡配體1可觸發(fā)PASMCs焦亡和肺血管纖維化，同時(shí)caspase-1抑制劑可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。本研究也發(fā)現(xiàn)，與常氧組比較，缺氧組細(xì)胞中的焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC的表達(dá)水平均顯著升高，同時(shí)其LDH的釋放量以及焦亡陽性細(xì)胞比例亦顯著升高。上述結(jié)果均提示缺氧誘導(dǎo)PASMCs焦亡是符合已有理論的。

Pue是從中藥野葛的干燥根中提取出的化合物，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多種炎性疾病的治療。張程美等[27]的研究表明，低、高劑量（10、100 μg/mL）的Pue均能下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平;除此之外，Pue不僅可以影響炎癥因子的表達(dá)，而且還可通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9等炎癥介質(zhì)，ICAM-1等細(xì)胞黏附分子，單核細(xì)胞趨化蛋白1、轉(zhuǎn)化生長因子β等炎癥趨化因子的水平，從而發(fā)揮抗炎作用[28]。因此，在綜合細(xì)胞焦亡機(jī)制的基礎(chǔ)上，筆者推測Pue可能具有減少炎癥因子釋放、緩解PAH的作用。同時(shí)，為減少因藥物純度不足或儲(chǔ)存不當(dāng)所造成的實(shí)驗(yàn)誤差，本研究在高度隨機(jī)和前期多次檢測的基礎(chǔ)上選用了Pue對(duì)照品并現(xiàn)用現(xiàn)配。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于缺氧24 h的PASMCs，0.2 mmol/L的Pue即可下調(diào)由缺氧引起的焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的升高，可減少LDH的釋放并降低焦亡陽性細(xì)胞比例，提示Pue在體外具有保護(hù)細(xì)胞膜完整性、減少炎癥因子釋放和下調(diào)焦亡陽性細(xì)胞比例的作用。

NLRP3炎性小體是巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在長期低氧環(huán)境的刺激下會(huì)觸發(fā)缺氧誘導(dǎo)分子1α（HIF-1α）的分泌，大量HIF-1α的累積使得肺動(dòng)脈細(xì)胞的有氧代謝平衡失調(diào)，繼而升高的NF-κB又進(jìn)一步上調(diào)NLRP3的表達(dá)，后者又可通過增加caspase-1的分泌而加重炎癥反應(yīng)[29-31]。以上研究提示，NLRP3炎癥小體可能是治療PAH的潛在靶點(diǎn)之一。雖有文獻(xiàn)曾報(bào)道過Pue與PAH之間的關(guān)系，但未有研究從細(xì)胞焦亡角度入手探討Pue與NLRP3炎癥小體的關(guān)系以及二者在PAH中的作用。因此，筆者構(gòu)建了NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒，在NLRP3炎癥小體異?；罨臈l件下初步探討了Pue對(duì)PASMCs焦亡的影響。結(jié)果顯示，NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒組中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC的表達(dá)水平均較缺氧+對(duì)照質(zhì)粒組顯著上調(diào)。這一方面表明NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，另一方面也提示NLRP3的異常活化可加劇炎癥因子的釋放。加入0.2 mmol/L Pue進(jìn)行干預(yù)后，焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，LDH的釋放量和焦亡陽性細(xì)胞比例均顯著降低，提示Pue可通過調(diào)控NLRP3炎癥小體抑制PASMCs的焦亡。

綜上所述，本研究證實(shí)了缺氧可誘導(dǎo)PASMCs焦亡并且激活NLRP3炎癥小體，而Pue可通過下調(diào)NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達(dá)、減少LDH的釋放、降低焦亡陽性細(xì)胞比例，從而發(fā)揮對(duì)缺氧致PASMCs焦亡的抑制作用，其機(jī)制可能與其抑制NLRP3炎癥小體的活性有關(guān)，提示Pue在PAH疾病預(yù)防及治療中存在潛在的應(yīng)用價(jià)值。為了更加全面地掌握焦亡與PAH之間的聯(lián)系以及Pue的調(diào)控機(jī)制，后期研究可從量-效、時(shí)-效關(guān)系入手深入探討，為臨床治療PAH奠定研究基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-01-18 修回日期：2021-04-20）

（編輯：張?jiān)拢?/p>