2種拮抗云杉梢枯病細(xì)菌的抑菌活性研究

曹娜 祝文博 黃麒 劉雪峰

摘 要：用平板對峙法研究貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）對云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼（Dothiorella gregaria）的抑菌活性，測定2種拮抗菌的生長曲線和不同培養(yǎng)時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵液抑菌活性及其穩(wěn)定性，通過光學(xué)顯微鏡研究抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，2種拮抗菌對云杉梢枯病病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率分別為57.50%、56.67%。貝萊斯芽胞桿菌發(fā)酵液0～12 h對病原菌菌絲體抑菌率幾乎為0;24 h抑菌率達(dá)到最大56.52%;24～72 h，抑菌率處于43.48%～47.83%。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液0～12 h對病原菌菌絲體抑菌率幾乎為0;24 h抑菌率達(dá)到最大52.17%;24～60 h，抑菌率處于47.83%～52.17%;60～72 h，抑菌率有所下降，抑菌率最低為43.48%。2種拮抗菌發(fā)酵液的抑菌活性隨著體積分?jǐn)?shù)的升高而上升。2種無菌濾液對溫度不敏感，經(jīng)不同酸堿度處理后抑菌活性下降。通過顯微鏡觀察，2種拮抗菌發(fā)酵液能使病原菌菌絲發(fā)生變粗彭大、表面粗糙等形態(tài)變化。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽胞桿菌;甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌;青海云杉;云杉梢枯病;抑菌活性

中圖分類號：S763.15 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? 文章編號：1006-8023（2021）03-0072-07

Abstract：The plate confrontation method was used to study the antibacterial activity of Bacillus velezensis and B. methylotrophicus against Dothiorella gregaria， and the grow curve of two kinds of antagonistic bacteria and the antibacterial activity of different incubation time and different concentration were measured. and antibacterial mechanism was studied by optical microscope. The results showed that two kinds of antagonistic bacteria had significant inhibition effect against D. gregaria with the antibacterial rate of 57.50% and 56.67%， respectively. The antibacterial rate of sterile culture filtrate of B. velezensis was nearly 0 from 0 to 12 h. The maximum antibacterial rate was 56.52% at 24 h， and the antibacterial rate was 43.48%-47.83% in 24-72 h. The antibacterial rate of sterile culture filtrate of B. methylotrophicus was nearly 0 from 0 to 12 h. The maximum antibacterial rate was 52.17% at 24 h， and the antibacterial rate was 47.83%-52.17% in 24-60 h. In 60-72 h， the antibacterial rate decreased， and the lowest was 43.48%. The antibacterial activity of two kinds of antagonistic bacteria sterile culture filtrate increased with the increase of the volume fraction. Two kinds of sterile culture filtrate was not sensitive to temperature and the antibacterial activity decreased after different pH treatment. Under the microscope， two kinds of antagonistic bacteria sterile culture filtrate can make hyphae coarsen， bent and enlarged.

Keywords：Bacillus velezensis; B. methylotrophicus; P. crassifolia Kom.; shoot blight of Picea asperata Mast; antibacterial activity

0 引言

青海云杉（Picea crassifolia Kom.）是松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）的一種珍貴樹種，為喬木，高度可達(dá)23 m，是中國特有的樹種，主要分布于我國祁連山區(qū)、青海、甘肅、寧夏以及內(nèi)蒙古大青山等海拔1 600～3 800 m的地帶[1-5]。該樹種木材性質(zhì)與云杉相似，高大、通直，結(jié)構(gòu)細(xì)致易加工，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，比如可供建筑、橋梁、家具及木纖維工業(yè)原料等用材。

云杉梢枯病病原菌為寄生小穴殼（Dothiorella gregaria），主要侵染青海云杉的嫩梢，導(dǎo)致嫩梢枯死，嚴(yán)重情況會導(dǎo)致整株死亡，給我國青海云杉帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。大多病害目前都處于物理防治和化學(xué)防治階段，而化學(xué)防治長久使用會給環(huán)境造成極大的危害，為解決這一問題，尋找低毒或無毒的生物防治方法成為了大趨勢[4-10]。

生物防治具有無毒、無污染和無殘留等優(yōu)點(diǎn)，芽孢桿菌近年也越來越多地應(yīng)用于對各種病害的防治中。貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）是革蘭氏陽性菌，桿狀，能產(chǎn)生芽孢，能抑制多種病害，是理想的廣譜生防菌[11-16]。張瓊等[17]用貝萊斯芽胞桿菌防治棉花黃萎病，王蕊等[18]從有機(jī)質(zhì)土壤中選育出一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BFWR11拮抗赤霉菌、灰霉菌和黑曲霉菌，均取得較好的抑制效果。本文主要研究2種芽孢桿菌對云杉梢枯病的抑菌活性，力求為云杉梢枯病的防治提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼，分離自寧夏南華山國家級自然保護(hù)區(qū)的青海云杉枯梢中。貝萊斯芽胞桿菌菌株（以下簡稱BLS）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株（以下簡稱JY）均分離自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山場部的冷杉葉片中。3者均已分離、純化、鑒定，保存于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室中。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Luria-Bertani固體培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 拮抗菌BLS、JY的抑菌活性測定

用平板對峙法進(jìn)行拮抗菌BLS、JY的抑菌活性測定。用直徑5 mm打孔器，于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的寄生小穴殼菌落邊緣打取菌餅，接于PDA平板中央，在其兩側(cè)距中心15 mm處劃線接種拮抗菌，以不接種拮抗菌為對照，置于恒溫培養(yǎng)箱中，25 ℃培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)。采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

η=（d1-d2）/（d1-5）×100%。

式中：η為抑菌率;d1為對照組菌落直徑;d2為試驗(yàn)組菌落直徑。

1.4 拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液不同發(fā)酵時(shí)間抑菌活性的測定

挑取拮抗菌BLS、JY的單菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)。每2 h取樣一次，分別測其生長曲線。取發(fā)酵液，用3層濾紙過濾，再將濾液于超凈工作臺中過0.22 μm的濾膜，得到2種拮抗菌的無菌濾液，每12 h取樣一次，分別測2種拮抗菌無菌濾液對寄生小穴殼的抑菌活性。分別比較2種拮抗菌的生長曲線和抑菌活性隨時(shí)間變化的關(guān)系，以及抑菌活性物質(zhì)積累的最佳培養(yǎng)時(shí)間，以未接菌的LB液體培養(yǎng)基為對照。

1.5 拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液不同體積分?jǐn)?shù)抑菌活性的測定

取搖培24 h的2種無菌濾液，混于50 ℃的PDA中，分別制成1%、10%、20%、30%、40%、50%體積分?jǐn)?shù)的帶藥平板，用直徑5 mm的打孔器，于培養(yǎng)3 d的寄生小穴殼菌落邊緣打取菌餅，接種于帶藥平板的中央，每組3個(gè)重復(fù)，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，測菌絲直徑，計(jì)算抑菌率。

1.6 拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性的測定

酸堿處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：取5份相同體積的BLS、JY無菌濾液，分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將無菌濾液的pH調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9，靜置2 h后再將pH調(diào)至7，過0.22 μm的濾膜[19]，以未處理的無菌濾液為對照，測抑菌活性，每組3個(gè)重復(fù)。

熱處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：分別取5份相同體積的BLS、JY無菌濾液，分別用0、20、40、60、80 ℃水浴鍋處理30 min[19]，以未處理的無菌濾液為對照，測抑菌活性，每組3個(gè)重復(fù)。

1.7 拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液對寄生小穴殼菌絲生長的影響

用直徑5 mm的打孔器，于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的寄生小穴殼菌落邊緣打取菌餅，接種于分別加入體積分?jǐn)?shù)50%的BLS、JY發(fā)酵液的PDA平板中央，以加入體積分?jǐn)?shù)50%的LB液體培養(yǎng)基的PDA平板為對照，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，挑取菌落邊緣菌絲，制成水載片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌BLS、JY對寄生小穴殼的抑制作用

通過平板對峙的結(jié)果可以觀察到：2種拮抗菌BLS、JY菌體均對寄生小穴殼的生長有抑制作用。抑菌率分別為57.50%±1.44%、56.67%±2.36%。如圖1所示。

2.2 拮抗菌BLS、JY的生長曲線及抑菌活性隨時(shí)間的變化

對拮抗菌BLS進(jìn)行生長曲線的測定，以求反映出菌體的生長狀況。結(jié)果如圖2所示。拮抗菌BLS在0～4 h為遲緩期，4～26 h為對數(shù)期，26 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，48 h后進(jìn)入衰亡期。對每12 h的BLS無菌濾液進(jìn)行抑菌效果測定，結(jié)果表明，0～12 h時(shí)間段內(nèi)BLS無菌濾液對寄生小穴殼幾乎無抑制作用，抑菌率為0;在24 h時(shí)，抑菌率達(dá)到最大;24～72 h，抑菌率有所下降;72 h時(shí)抑菌率最低。此結(jié)果表示，BLS無菌濾液在不同時(shí)間段里抑菌效果差異顯著（P<0.05）。

對拮抗菌JY進(jìn)行生長曲線的測定，結(jié)果如圖3所示。拮抗菌JY在0～4 h為遲緩期，4～36 h為對數(shù)期，36 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，48 h后進(jìn)入衰亡期。對每12 h的JY無菌濾液進(jìn)行抑菌效果測定，結(jié)果表明，0～12 h時(shí)間段內(nèi)JY無菌濾液對寄生小穴殼無抑制作用，抑菌率為0;在24 h時(shí)，抑菌率達(dá)到最大;24～72 h，抑菌率均有所下降。此結(jié)果表示，JY無菌濾液在不同時(shí)間段里抑菌效果差異顯著（P<0.05）。

2.3 拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液不同體積分?jǐn)?shù)的抑菌活性

拮抗菌BLS不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液無菌濾液，對寄生小穴殼菌絲的抑菌活性如圖4所示。隨著發(fā)酵液無菌濾液體積分?jǐn)?shù)的上升，對病原菌的抑菌活性明顯升高。其中體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，抑菌效果最好，抑菌率為70.37%±2.62%。

拮抗菌JY不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液無菌濾液，對寄生小穴殼菌絲的抑菌活性如圖5所示。隨著發(fā)酵液無菌濾液體積分?jǐn)?shù)的上升，對病原菌的抑菌活性明顯升高。其中體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，抑菌效果最好，抑菌率為68.52%±2.62%。

2.4 拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液抑菌活性的穩(wěn)定性

2種拮抗菌的發(fā)酵液，經(jīng)不同酸堿度處理后，對寄生小穴殼菌絲生長的抑制作用均有所減弱，差異顯著;經(jīng)0、20、40、60、80 ℃水浴鍋處理30 min后，BLS對寄生小穴殼菌絲生長的抑制作用變化顯著，JY對寄生小穴殼菌絲生長的抑制作用變化不顯著。如圖6和圖7所示。

2.5 拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液無菌濾液處理后寄生小穴殼菌絲的變化

經(jīng)2種發(fā)酵液處理后，病原菌分別出現(xiàn)菌絲變粗彭大、表面粗糙的變化。說明2種拮抗菌發(fā)酵液對寄生小穴殼菌絲的生長有一定的抑制作用。如圖8所示。

3 結(jié)論與討論

在本研究中，2種拮抗菌發(fā)酵液對云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼（D. gregaria）的菌絲均有抑制作用，最大抑菌率分別為57.50%±1.44%、56.67%±2.36%，且在發(fā)酵24 h時(shí)抑菌效果最佳。這說明了在2種拮抗菌的發(fā)酵過程中，確實(shí)都產(chǎn)生了能夠抑制寄生小穴殼菌絲生長的次生代謝產(chǎn)物。由此可得，2種拮抗菌發(fā)酵后，對于抑制云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼具有極高的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)對2種拮抗菌的拮抗作用和抑菌活性進(jìn)行了研究，體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，2種拮抗菌抑菌效果最好，抑菌率分別為70.37%±2.62%、68.52%±2.62%，這為下一步抑菌活性物質(zhì)的提取鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化和田間防治等提供了良好的基礎(chǔ)。

2種拮抗菌的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)酸堿、熱等處理，均具有較好的穩(wěn)定性，這為未來研發(fā)為生物制劑提供了良好的依據(jù)。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分別經(jīng)2種拮抗菌發(fā)酵液處理后的病原菌，菌絲發(fā)生了變粗彭大、表面變粗糙等變化。具體的抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

使用生物防治不僅有無毒無害的優(yōu)點(diǎn)，還具有無殘留等優(yōu)點(diǎn)，是未來病害防治必然要采取的措施之一，貝萊斯芽胞桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對林木病害的防治具有廣譜性，對多種病害都有抑制作用，如趙昱榕等[20]用從黃瓜植株體內(nèi)分離鑒定出的貝萊斯芽胞桿菌（B. velezensis）抑制多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）。本研究中使用貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）分別拮抗云杉梢枯病的病原菌寄生小穴殼（D. gregaria），均取得較好的抑菌效果。在國內(nèi)，尚比較少見用這2種拮抗菌拮抗云杉梢枯病的相關(guān)報(bào)道，以期本研究能為云杉梢枯病的防治提供更多的依據(jù)。

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