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    A型肉毒梭菌培養(yǎng)基中植物水解蛋白替代胰酪蛋白胨的可行性分析

    2021-07-20 09:44:52王云天陳蘇玲苗承輝陸儉李晨昊何星
    中國生物制品學(xué)雜志 2021年7期
    關(guān)鍵詞:肉毒酪蛋白梭菌

    王云天,陳蘇玲,苗承輝,陸儉,李晨昊,何星

    蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司毒素制劑室,甘肅蘭州730046

    肉毒梭菌是一種能形成芽胞的革蘭陽性厭氧菌,可產(chǎn)生A~G 7種不同的神經(jīng)毒素[1]。A型肉毒毒素廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和美容行業(yè)[2],其原理是A型肉毒毒素阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)的乙酰膽堿受體,導(dǎo)致神經(jīng)信號不能傳導(dǎo)而引起肌肉松弛[3-4]。蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的注射用A型肉毒毒素(商品名:衡力?)是我國批準(zhǔn)上市,以治療和美容為目的的唯一國內(nèi)產(chǎn)品[5],是由產(chǎn)毒較高的A型肉毒梭菌Hall株經(jīng)產(chǎn)毒培養(yǎng)、純化等一系列生產(chǎn)過程制備,在產(chǎn)毒培養(yǎng)階段,培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源是用動(dòng)物源性的胰酪蛋白胨提供的。為避免在A型肉毒毒素產(chǎn)品中引入其他外源性病毒的隱患,考慮用植物水解蛋白(tryptonesubstitute,TS)替代。TS是非動(dòng)物源性(aminalorigin free,AOF)氮源,與胰酪蛋白胨相比,其相對分子質(zhì)量較小,易于被細(xì)菌生長所吸收,且其碳水化合物總量較高,能在細(xì)菌生長后期提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)來源[6],是動(dòng)物源性有機(jī)氮源的可能替代物。本文對以TS作為主要成分的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的A型肉毒梭菌的產(chǎn)毒力以及生產(chǎn)的收獲物進(jìn)行研究,分析TS替代胰酪蛋白胨的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 菌株 A型肉毒梭菌Hall株由美國威斯康辛大學(xué)食品研究所1984年惠贈(zèng),現(xiàn)保存于蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司菌種庫。

    1.2 培養(yǎng)基 TYG(胰酪蛋白胨-酵母浸出粉-葡萄糖)培養(yǎng)基由蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司毒素制劑室2015年制備,批號分別為20150101、20150302、20150403、20150504、20150605、20150906、20151007。

    1.3 主要試劑及儀器 胰酪蛋白胨和酵母浸出粉購自英國OXOID公司;葡萄糖購自山東祥瑞藥業(yè)有限公司;TS購自美國UNITED STATESBIOLOGICAL公司;Thermo6000系列培養(yǎng)箱購自美國THERMO公司;HI123臺(tái)式酸度測定儀購自美國漢娜公司;UV-1206型分光光度計(jì)購自日本島津公司。

    1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及毒力測定方法 SPF級昆明小鼠,雌性,26~30日齡,由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供,動(dòng)物使用許可證號:SYXK(甘2012-0001)。培養(yǎng)基產(chǎn)毒力測定方法是采用尾靜脈注射的方法(Broff法)[7],用IV(intravenous injection)毒力表示;收獲物檢定時(shí)毒力測定方法是采用腹腔注射的方法[7],用IP(intraperitoneal injection)毒力表示。

    1.5 收獲物檢定方法 吸光度比值:樣品在260和280 nm波長處的吸光度的比值(A260/A280);蛋白濃度:A280/1.66[8];純度:IP毒力 /蛋白濃度;蛋白質(zhì)圖譜:SDS-PAGE法(4%~12%梯度膠)檢測結(jié)晶毒素的蛋白組成[7]。

    1.6 培養(yǎng)基T S濃度的篩選試驗(yàn)

    1.6.1 產(chǎn)毒力篩選試驗(yàn) 其他成分濃度不變,分別配制TS濃度為3%、4%、5%、6%、7%的培養(yǎng)基于血漿瓶中,250 mL/瓶,115℃,30 min滅菌處理后,接種A型肉毒梭菌,于35℃培養(yǎng)120 h,測定培養(yǎng)液產(chǎn)毒力是否≥1×105LD50/mL(A型肉毒梭菌產(chǎn)毒力內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn))[7]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.6.2 純化篩選試驗(yàn) 按1.6.1項(xiàng)結(jié)果選擇培養(yǎng)基產(chǎn)毒力平均值最高的3種TS濃度,培養(yǎng)基其他成分濃度不變,分別配制3種TS濃度的培養(yǎng)基,各1瓶,9 000 mL/瓶,115℃,30 min滅菌處理后,接種A型肉毒梭菌,于35℃培養(yǎng)120 h。測定培養(yǎng)液產(chǎn)毒力后,采用注射用A型肉毒毒素的生產(chǎn)工藝對培養(yǎng)液進(jìn)行純化,對比純化結(jié)果,篩選出適合生產(chǎn)工藝的TS濃度。

    1.7 T S YG(植物水解蛋白-酵母浸出粉-葡萄糖)培養(yǎng)基放大培養(yǎng)試驗(yàn)

    1.7.1 正常生產(chǎn)規(guī)模的產(chǎn)毒力試驗(yàn) 選擇1.6.2項(xiàng)篩選的最佳TS濃度制備3批培養(yǎng)基,批號分別為試20150101、試20150502和試20151103,每批培養(yǎng)基總量為27 000 mL,分裝于立瓶,9 000 mL/瓶,共3瓶,115℃,30 min滅菌處理后,接種A型肉毒梭菌,于35℃培養(yǎng)120 h。測定培養(yǎng)液產(chǎn)毒力,確認(rèn)放大至生產(chǎn)規(guī)模后產(chǎn)毒力是否 ≥1×105LD50/mL,并與TYG培養(yǎng)基的產(chǎn)毒力效果進(jìn)行比較。

    1.7.2 TSYG培養(yǎng)基收獲物檢定 用3批(試2015-0101、試20150502和試20151103)TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物,采用注射用A型肉毒毒素的生產(chǎn)工藝。收獲物對應(yīng)批號為試H-20150101、試H-20150502和試H-20151103。檢測收獲物的質(zhì)控參數(shù)結(jié)晶毒素收率、IP毒力、吸光度比值、純度和蛋白質(zhì)圖譜是否符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[7]。

    1.8 T S YG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)的對比 對3批(試20150101、試20150502和試20151103)TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物(對應(yīng)批號分別為試H-20150101、試H-20150502、試H-2015-1103)及7批(20150101、20150302、20150403、20150-504、20150605、20150906、20151007)TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物(對應(yīng)批號分別為H-20150101、H-2015-0302、H-20150403、H-20150504、H-20150605、H-201-50906、H-20151007),進(jìn)行關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)結(jié)晶毒素收率和純度的分析。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,成組t檢驗(yàn)方法分析不同培養(yǎng)基的產(chǎn)毒力以及收獲物的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)結(jié)晶毒素收率和純度,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 培養(yǎng)基T S濃度的篩選

    2.1.1 產(chǎn)毒力篩選 TS濃度為3%、4%、5%、6%、7%的培養(yǎng)液,IV毒力均≥1×105LD50/mL,符合培養(yǎng)基產(chǎn)毒力要求,見表1。選擇產(chǎn)毒力結(jié)果平均值較高的3%、4%和5%3個(gè)TS濃度進(jìn)行下一步純化篩選。

    表1 產(chǎn)毒力篩選試驗(yàn)結(jié)果(×105 LD50/mL)Tab.1 Screening of toxigenic capacity(×105 LD50/mL)

    2.1.2 純化篩選 3種TS濃度的培養(yǎng)液IV毒力均≥1×105LD50/mL,TS濃度5%的培養(yǎng)液IV毒力為9.80×105LD50/mL,高于另外2種濃度。純化過程中,TS濃度3%的培養(yǎng)液在提取-離心階段固液未分,導(dǎo)致純化不能繼續(xù),廢棄;TS濃度4%和5%的培養(yǎng)液純化結(jié)果均符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。TS濃度5%的培養(yǎng)液產(chǎn)毒力及純化的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)(純度和蛋白收率)均優(yōu)于TS濃度4%的培養(yǎng)液,因此選擇5%作為放大培養(yǎng)的TS濃度。見表2。

    表2 不同TS濃度培養(yǎng)液純化結(jié)果Tab.2 Purification of toxin produced by culture medium at various TSconcentrations

    2.2 T S YG培養(yǎng)基放大培養(yǎng) 3批放大至正常生產(chǎn)量的TSYG培養(yǎng)基,經(jīng)產(chǎn)毒培養(yǎng)后,IV毒力均≥1×105LD50/mL,符合培養(yǎng)基產(chǎn)毒力質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。TSYG培養(yǎng)基與TYG培養(yǎng)基產(chǎn)毒力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.529,P=0.615),見表3,表明TSYG培養(yǎng)基的產(chǎn)毒效果不低于TYG培養(yǎng)基。

    表3 TSYG培養(yǎng)基與TYG培養(yǎng)基產(chǎn)毒力對比Tab.3 Comparison of toxigenic capacities of TSYGand TYGculture media

    2.3 T S YG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的檢定結(jié)果 3批TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的結(jié)晶毒素收率均在0.8~7.0 mg/L之間,吸光度比值均 <0.60,IP毒力均 >1.00×106LD50/mL,純度均 >1.00×107LD50/mg,均符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn);在非還原和還原條件下電泳圖譜均與參考品一致。見表4和圖1。3批TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的檢定結(jié)果全部符合要求。

    圖1 結(jié)晶毒素SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE profile of crystal toxin

    表4 TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果Tab.4 Quality indexes of toxin produced by TSYG medium

    2.4 T S YG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)對比結(jié)果 TSYG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的結(jié)晶毒素收率、純度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為1.424和-1.513,P分別為0.178和0.154),見表5。表明TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物質(zhì)量并不低于TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物。

    表5 TSYG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的關(guān)鍵參數(shù)對比Tab.5 Comparison of main parameters of toxin produced by TSYGand TYGculture media

    3 討論

    在A型肉毒梭菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基的作用是為細(xì)菌生長提供充足的營養(yǎng)。對注射用A型肉毒毒素制品而言,不但需要培養(yǎng)基產(chǎn)毒力符合要求,而且殘留物也不能對純化產(chǎn)生影響,能夠用現(xiàn)有工藝生產(chǎn)出符合要求的結(jié)晶毒素。

    本研究用TS配制的培養(yǎng)基接種肉毒梭菌后,在培養(yǎng)過程中,細(xì)菌生長良好,產(chǎn)氣旺盛,產(chǎn)毒力符合《中國藥典》三部(2015版)[7]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),與胰酪蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)A型肉毒梭菌相比無差異性。

    原液檢定的重要指標(biāo)是純度及蛋白含量,純度決定了成品中A型肉毒毒素的實(shí)際蛋白含量,人體使用純度不高的產(chǎn)品會(huì)導(dǎo)致抗體產(chǎn)生,而原液的純度也得益于培養(yǎng)收獲物中的毒素含量和純度。雖然目前沒有文獻(xiàn)證明A型肉毒毒素制品注射到人體內(nèi)有抗體產(chǎn)生,但為了降低風(fēng)險(xiǎn),蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)原液所選用的培養(yǎng)收獲物毒素含量均在3.0×107LD50/mg以上,本次實(shí)驗(yàn)中批號為試H-20150502的收獲物純度為3.79×107LD50/mg,完全符合生產(chǎn)原液的標(biāo)準(zhǔn)。

    3批TSYG培養(yǎng)液經(jīng)現(xiàn)有工藝純化,純化過程各項(xiàng)參數(shù)與現(xiàn)行生產(chǎn)工藝基本無差異,其收獲物的檢定結(jié)果也均符合《中國藥典》三部(2015版)[7]規(guī)定的A型肉毒毒素收獲物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。因此可以確定,用TS替代胰酪蛋白胨是可行的。

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