黃酮類化合物提取、分離純化方法研究現(xiàn)狀及展望

徐赫，李榮華，夏巖石，楊新泉

(廣州大學 生命科學學院，廣東 廣州 510006)

黃酮類化合物是植物次生代謝中的一種重要產(chǎn)物，廣泛分布于植物體的各個部位。其結(jié)構(gòu)特征為含有兩個或多個芳香環(huán)，且每個芳香環(huán)至少含有一個芳香羥基，并與一個雜環(huán)吡喃相連。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可將黃酮類化合物分為以下幾類：黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、二氫黃酮醇類、異黃酮類、二氫異黃酮類、查爾酮類、橙酮類及花色素類等。研究發(fā)現(xiàn)，植物黃酮如蘆丁、槲皮素、水仙苷、異鼠李素及煙花苷等具有抗氧化和清除自由基的能力[1]，部分植物黃酮如懈皮素、染料木素、蘆丁及柚皮苷等多種黃酮類物質(zhì)具有優(yōu)異的抗腫瘤能力[2]，一些植物黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和灰葡萄孢菌等有顯著的抑制效果[3]。如何高效、安全地提取和純化黃酮類化合物是當今黃酮類物質(zhì)廣泛研究的基礎，黃酮類化合物因結(jié)構(gòu)以及存在部位的不同，提取及純化方式也有所不同。本文綜述了黃酮類化合物提取、純化方法的研究現(xiàn)狀及特點，并對黃酮類化合物分離提取的前景進行了展望。

1 黃酮類化合物的提取方法

近年來用來提取黃酮類化合物的主要方法有：有機溶劑提取法、微波提取法、超聲提取法、半仿生提取法、酶提法、蒸汽爆破法、超臨界CO2萃取法和亞臨界流體萃取法等,見表1。

表1 黃酮類化合物提取方法比較Table 1 Comparison of extraction methods of flavonoids

1.1 有機溶劑提取法

近年來提取黃酮類化合物多數(shù)采用有機溶劑提取，其原理是利用黃酮類物質(zhì)易溶于有機溶劑的特點，采用浸提、回流提取及索氏提取法等提取方法將黃酮類物質(zhì)從植物組織內(nèi)部溶解出來。一般認為有機溶劑濃度越高越有利于提取效果，但是也不宜過高，因為植物中還存在大量的醇溶性雜質(zhì)，濃度過高易使雜質(zhì)溶解度增加，對結(jié)果形成干擾[4]。有機溶劑提取法中常用于植物黃酮提取的溶劑是乙醇、甲醇和丙酮，在其他條件相同情況下，使用丙酮溶液提取的總黃酮得率略高于乙醇，甲醇相對較低，考慮到乙醇相對成本低且毒性小等特點，選乙醇作為提取劑為更佳[5]。盡管有機溶劑提取法操作簡單、成本低，但所需提取時間相對較長，效率低且提取物活性損失較大，不適用于工業(yè)大規(guī)模提取[6]。

1.2 微波輔助提取法

微波輔助提取植物黃酮的機理是微波產(chǎn)生的高頻電磁波穿透有機溶劑，使植物細胞破裂，細胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)可自由流出，更易于將黃酮類物質(zhì)從植物組織內(nèi)部溶解出來；同時微波產(chǎn)生的磁場還可加速黃酮類物質(zhì)的溶解，使植物黃酮可以更快捷簡便的被分離提取[7]。張艷等[8]在紫蘇油粕總黃酮提取研究中，對比了微波輔助法及傳統(tǒng)有機溶劑提取法對總黃酮得率的影響，發(fā)現(xiàn)微波輔助法的提取率較有機溶劑提取法高54.31%，且提取時間明顯縮短，說明微波輔助提取法相比于傳統(tǒng)的有機溶劑提取法更高效。在茼蒿葉黃酮提取研究中，張祿捷等[9]以微波輔助提取為基礎的最佳工藝參數(shù)：發(fā)現(xiàn)以73 ℃微波溫度，400 W的微波功率微波8 min，并在30∶1的料液比以及68%乙醇體積分數(shù)下提取效果最佳，總黃酮提取率為0.55%?？偟膩碚f，微波輔助提取法操作簡單，均勻加熱的特性不僅提高了效率還可有效保護其生物活性，在植物黃酮提取實驗中有極大的可行性。

1.3 超聲輔助提取法

超聲輔助提取黃酮的主要機理是利用超聲波產(chǎn)生的機械作用、熱作用和空化作用，植物樣品中產(chǎn)生強壓和溫度梯度，促使細胞結(jié)構(gòu)破壞，細胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)可自由流出，更易于將黃酮類物質(zhì)從植物組織內(nèi)部溶解出來[10]；因此，超聲輔助提取法可增加植物黃酮運動的頻率和速度，溶劑的滲透能力，及目標組分向溶劑中的滲透速率[11]。劉海鵬等[12]對銀杏葉總黃酮物質(zhì)提取工藝中，對比了乙醇回流提取法和超聲輔助提取法的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲提取法的黃酮提取率為96%，而乙醇回流法的提取率為89%。林繼元等[13]使用超聲輔助提取廣西甜茶黃酮類物質(zhì)時，確定最佳工藝為：30%乙醇濃度，料液比1∶30，提取溫度40 ℃以及40 min提取時間，獲得了3.85%的得率，相比傳統(tǒng)回流法的約2.1%得率，提取效果顯著。該方法獲得極佳提取率的同時，節(jié)約了成本。與微波輔助提取法相比，超聲波的能量屬性可避免高溫的影響，且由于其波動性質(zhì)，可加速提取物的溶解[14]，因此超聲提取法在植物黃酮分離提取研究中被廣泛使用。

1.4 酶提法

酶法提取植物黃酮是一種新興提取技術(shù)，其原理是利用酶解作用，對植物基質(zhì)進行酶解，以完成對目標物質(zhì)的提取。一般來說，酶法提取黃酮類化合物主要采用細胞壁降解酶如纖維素酶和果膠酶等來酶解植物細胞壁，使得細胞內(nèi)的黃酮類化合物更易于溶解至溶劑[15]。與傳統(tǒng)有機溶劑提取法相比，酶法提取黃酮類化合物的優(yōu)勢在于提取效率高、條件溫和。段宙位等[16]對菠蘿蜜果皮黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究中，分別使用有機溶劑提取法及酶法提取進行實驗，并對比其黃酮得率，確定了酶法提取的最佳工藝為：選用濃度為30 U/g的果膠酶，時間2 h， 再經(jīng)乙醇濃度為80%，料液比為1∶20，pH 5.5及提取溫度為55 ℃，結(jié)果表明有機溶劑提取法黃酮總得率僅為3.05%，而酶法提取的總得率為4.98%，提取率提高1.94%。

1.5 半仿生提取法

半仿生提取法是張兆旺等根據(jù)“灰思維方式”提出的新提取方法，它是一種遵循人體胃腸環(huán)境特點的特殊提取工藝。它從生物藥劑學的角度出發(fā)，將待提取液經(jīng)過不同酸堿度的溶劑連續(xù)提取，模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸轉(zhuǎn)運的過程，在提取液中加入人體消化系統(tǒng)內(nèi)的多種消化酶，目的是使提取過程模擬待提取物在人體中的吸收過程，以便于更好的保留有效成分[17]。郭志紅等[18]在玉米須總黃酮提取工藝的研究中，使用半仿生提取技術(shù)，并與有機溶劑提法進行比較，結(jié)果表明：半仿生醇提法黃酮提取量為15.59 mg/g，比傳統(tǒng)有機溶劑提取法高59.4%。不僅效率更高，而且半仿生提取法不使用有機溶劑，萃取過程中不存在有機溶劑殘留；但一直以來，此方法仍沿用高溫煎煮的方式，可能會影響有效成分的活性；為了避免對熱敏感的組分的損傷，有研究在接近人體溫度下提取發(fā)現(xiàn)效果更佳[19]。

1.6 蒸汽爆破法

蒸汽爆破技術(shù)是一種預處理技術(shù)，目前對生物活性物質(zhì)提取工藝的研究中是最有前景的預處理技術(shù)之一。其主要原理是將植物樣品置于蒸氣中并加壓，保證反應時間，使得蒸汽可以滲入植物細胞中，然后通過瞬間降低氣壓，使熱能轉(zhuǎn)化成機械能，至細胞破裂，使提取物可與提取溶劑更充分接觸，有利于進一步加工處理[20]。與傳統(tǒng)的有機溶劑萃取法相比，蒸汽爆破技術(shù)可顯著提高效率、縮短提取時間，更適用于工業(yè)規(guī)模的開發(fā)。與一些黃酮提取技術(shù)的替代工藝如超臨界流體萃取、微波和超聲波輔助萃取等相比，蒸汽爆破技術(shù)的主要優(yōu)點是不需要使用有害的化學物質(zhì)和溶劑，更利于環(huán)保[21]。Qin等[22]系統(tǒng)地研究了未經(jīng)處理和蒸汽爆破處理對無花果葉總黃酮提取的影響，確定了蒸汽爆破處理的最佳工藝為：蒸汽壓力0.2 MPa，處理時間3 min。并發(fā)現(xiàn)蒸汽爆炸預處理后，從無花果葉中提取的黃酮類化合物的產(chǎn)量比未經(jīng)處理的無花果葉提高了55.9%。但是在較劇烈的蒸汽爆炸條件下(0.4 MPa,3 min)，黃酮類化合物的得率并沒有提高，這可能是由于預處理溫度較高時，黃酮類化合物受到了破壞。由此看出，適當強度的蒸汽爆破預處理對黃酮類化合物提取效果顯著。

1.7 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2萃取法的原理是在高壓狀態(tài)下使二氧化碳達到超臨界，利用超臨界CO2對黃酮類物質(zhì)的特殊溶解作用將其溶解，再經(jīng)過減壓使CO2汽化，從而得到黃酮類物質(zhì)，這種方法極大地解決了有機溶劑殘留問題[23]。華燕青等[24]采用超臨界CO2萃取法對薄荷總黃酮提取工藝進行了優(yōu)化，優(yōu)化工藝條件為：夾帶劑乙醇濃度為70%，用量6 mL/g，萃取壓力25 MPa，萃取溫度55 ℃，萃取時間90 min，可獲得3.72%的黃酮得率?？偟膩碚f超臨界CO2萃取法有機溶劑用量少，節(jié)約了成本，黃酮得率相對較高，且CO2無毒且廉價，達到超臨界態(tài)的溫度較低，可以保證實驗的安全性。但超臨界CO2萃取法能耗高，設備要求高，自動化連續(xù)生產(chǎn)難，故多用于科學研究，不適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[25]。

1.8 亞臨界流體萃取法

亞臨界萃取法是植物黃酮分離提取研究中的新興提取技術(shù)，原理是將提取劑加熱至亞臨界狀態(tài)，即沸點之上但仍保持為液態(tài)的狀態(tài)，改變?nèi)軇┓肿拥臉O性和表面張力，使一些原本難溶于溶劑的黃酮類物質(zhì)溶解度顯著增加，更利于提取分離[26]，該方法有提取速率快、設備容積大及節(jié)能等優(yōu)點，廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)[27]。

亞臨界流體萃取溶劑類型有水及有機溶劑等，其中亞臨界水萃取法是研究熱點之一，水是一種易得、無毒且環(huán)境友好型溶劑，亞臨界水對于植物黃酮的萃取有提取效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點[28]。高如意等[29]使用亞臨界水萃取法，對油菜花粉中黃酮類物質(zhì)進行分離提取，優(yōu)化了提取工藝，效果顯著。但亞臨界水萃取法的不足之處在于：為了達到實驗目的需要很高的溫度才能使水達到亞臨界，這很有可能會破壞黃酮類物質(zhì)的生物活性[30]。選用有機溶劑作為萃取劑很好的避免了亞臨界水萃取的不足，并由于蒸發(fā)分離的緣故，有機溶劑可重復使用，有利于環(huán)保。李禹辰等[27]實驗中使用有機溶劑丙酮作為萃取劑，采用單因素實驗優(yōu)化了提取工藝，其總黃酮得率為15.03%。

2 黃酮類化合物分離純化方法

黃酮類化合物的分離純化方法主要包括柱層析色譜法和膜分離法等，見表2。

表2 黃酮類化合物分離純化方法比較Table 2 Comparison of separation and purification methods of flavonoids

2.1 柱層析色譜法

聚酰胺、硅膠及葡萄糖凝膠柱色譜法在植物活性物質(zhì)的分離純化中應用廣泛，同樣也適用于植物黃酮的分離純化。

2.1.1 硅膠柱色譜法 硅膠是一種極性吸附劑，為多孔性物質(zhì)，其吸附作用機理與硅醇基含量有關，其吸附能力隨硅醇基吸水量的增加而降低。但硅膠對黃酮類物質(zhì)有很強的吸附能力，且硅膠內(nèi)含有的金屬離子極易與黃酮類物質(zhì)絡合而難被洗脫，因此在硅膠預處理中應使用濃鹽酸充分清洗，以去除金屬離子對實驗的干擾[31]。唐少華等[32]對大豆黃酮分離的研究中，使用硅膠柱層析法分離得到的產(chǎn)物純度達到90%以上。但是，傳統(tǒng)硅膠柱層析法耗時間、耗溶劑，且容易產(chǎn)生死吸附。近年來，為了進一步提高分離效率，閃式硅膠柱色譜法被廣泛關注，使用閃式硅膠柱可顯著縮短上樣時間，減少死吸附，與傳統(tǒng)硅膠相比極大的提高了效率和產(chǎn)品純度。王雯麗等[33]使用閃式硅膠柱色譜法純化厚樸總酚，確定了最佳工藝為：使用10倍量的硅膠裝柱，洗脫溶劑選用石油醚-醋酸乙酯(10∶1～10∶3)進行梯度洗脫，洗脫速率5 mL/min，并與傳統(tǒng)硅膠提取工藝進行比較，發(fā)現(xiàn)閃式硅膠柱色譜法純化質(zhì)量分數(shù)為60%的乙醇提取液，所得厚樸總酚質(zhì)量分數(shù)>99.5%，相對于傳統(tǒng)硅膠柱層析分離的98%的總酚質(zhì)量分數(shù)，提高了1.5%。

2.1.2 葡聚糖凝膠柱色譜法 葡聚糖凝膠是一種新型吸附劑，對多種生物活性物質(zhì)有很好的吸附效果，最常用到的是羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20，該型凝膠純化效率高、雜質(zhì)少且可多次循環(huán)使用[34]。研究表明葡聚糖凝膠對游離黃酮中的酚羥基有吸附作用，游離黃酮中的酚羥基越多則吸附力越強，洗脫時在凝膠柱上滯留時間越長，可用于不同種類黃酮的分離制備；但過多酚羥基的黃酮類物質(zhì)由于吸附作用過強，導致洗脫難度較大，難以進行進一步分離純化[35-36]。而對黃酮甙，葡聚糖凝膠則主要起分子篩的作用；因為葡聚糖凝膠在溶劑中成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使小分子滲入，大分子則隨溶劑先行流出，而流入葡聚糖凝膠內(nèi)部的小分子則以分子量由大到小先后流出，從而達到分離的目的。姚開等[37]在大豆異黃酮主要單體成分分離的研究中，采用Sephadex LH-20凝膠柱進行實驗，以90%甲醇作為洗脫劑、按2.0 mL/min流速洗脫，分別獲得純度為95.7%和95.1%的染料木苷和大豆苷?？梢娖暇厶悄z柱色譜法純化黃酮類物質(zhì)可獲得極高的純度。

2.1.3 聚酰胺柱色譜法 聚酰胺柱色譜法分離植物黃酮是利用黃酮類物質(zhì)中的酚羥基與聚酰胺分子中游離胺基與醌類等作用形成氫鍵，達到吸附作用，再經(jīng)洗脫得到純度較高的植物黃酮[38]。聚酰胺柱色譜法具有高效、分離效果好等優(yōu)勢，并且聚酰胺樹脂由于其不殘留有毒的有機溶劑及重金屬物質(zhì)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。王克勤等[39]在芹菜黃酮分離純化研究中，用聚酰胺吸附法純化黃酮含量19.14%的粗提液，純化后的溶液黃酮純度高達80%，純化效果極佳。馮愛博等[40]對竹筍殼黃酮類物質(zhì)的純化實驗中，對比聚酰胺和大孔樹脂兩種材料的純化效果，發(fā)現(xiàn)使用聚酰胺吸附法所得總黃酮得率略高，證明聚酰胺對黃酮類物質(zhì)的選擇性更佳。但聚酰胺材料的死吸附較大，使已吸附黃酮類物質(zhì)不能充分洗脫，有時會導致?lián)p失量較大；因此，在上樣量較少時應謹慎使用。

2.1.4 大孔樹脂柱色譜法 大孔樹脂是一種有機高分子聚合物，其吸附原理是利用分子間的范德華力，通過巨大的比表面從溶劑中吸附黃酮類物質(zhì)，再經(jīng)洗脫得到純度較高的黃酮類物質(zhì)。大孔樹脂柱色譜法因具有選擇性好、吸附量大和節(jié)約成本等優(yōu)點，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，在植物黃酮提取液的純化中備受青睞[41]。馮靖等[42]用DPH-100型號大孔樹脂對黃酮粗提液進行純化時，純化前提取液濃度為25%，在最佳工藝條件下，純化后濃度達到了74%，且樹脂可重復使用6次。但疏水性較強的大孔樹脂具有較多的非特異性吸附，導致產(chǎn)物純度較低。為解決此問題，王芃等[43]制備了以丙烯酸甲酯(MA)-二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)共聚的酰胺基化合成樹脂(MA-EGDMA)，顯著降低了樹脂的非特異性吸附，純化后的黃酮質(zhì)量分數(shù)提高了30%。因此，合成樹脂法顯著改善了大孔樹脂吸附法產(chǎn)物純度較低的不足，值得深入探討。

2.2 膜分離法

膜分離法即用膜實現(xiàn)不同物質(zhì)分離的方法，其原理是利用膜的選擇性滲透作用，將提取液流過膜，通過外界壓力、濃度及電勢差等作用下，使只有分子量小于膜孔徑物質(zhì)的通過膜，從而達到物質(zhì)的分離純化目的[44]。根據(jù)孔徑大小膜分離法中使用的膜可分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等。其中超濾法最具代表性，該法不需要經(jīng)過相變或加輔助劑，僅通過控制膜的孔徑來提取目標物質(zhì)，十分節(jié)能環(huán)保。此法工藝簡單、且純化效果好，在植物黃酮分離提取工藝研究中潛力巨大，但該法不適用于分子量相差不大的黃酮類化合物的分離純化，且膜的滲透性會隨時間而降低，降低膜的分離性能[45]。孫曉春等[46]在桔梗總黃酮分離研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.2 μm孔徑的膜純化后，不僅黃酮提取率高達66.58%，且對·OH 和DPPH·的清除率分別高達68.42%和90.50%。

3 展望

目前植物中黃酮類物質(zhì)的分離提取工藝已經(jīng)相當成熟，但仍存在選擇性差，污染環(huán)境，工業(yè)應用成本高等缺點。在今后的研究過程中，應向著更低成本，更適用于大規(guī)模生產(chǎn)及更高選擇性等方向發(fā)展。一方面對傳統(tǒng)工藝進行優(yōu)化；一方面開發(fā)新的方法。比如：通過改造設備提高性能來優(yōu)化工藝，增加有機溶劑的回收裝置以及盡可能的將設備功能最大化利用等；嘗試將現(xiàn)有的提取工藝與高新技術(shù)相結(jié)合，可以以幾種分離提取方式為基礎，建立一種連續(xù)的分離提取設備、讓提取過程更加高效、安全、無污染，使得黃酮這一優(yōu)質(zhì)天然的資源獲得更廣泛的利用。本文綜述的內(nèi)容，以期為植物中黃酮類物質(zhì)的提取和分離純化提供參考。