恩施續(xù)斷中含硒化合物體外抗氧化活性分析

王應玲，李艷君，張 馳*

(1．湖北省地質局 第二地質大隊，湖北 恩施445000;2．湖北民族學院 生物科學與技術學院，湖北 恩施445000;3．生物資源保護與利用湖北省重點實驗室( 湖北民族學院) ，湖北 恩施445000)

續(xù)斷為川續(xù)斷科川續(xù)斷(Dipsacus asperWatl )屬植物川續(xù)的根．又名川斷，是該屬的模式種［1］．國內外對續(xù)斷已有大量的研究，主要集中在化學成分和藥理作用等方面，對富硒續(xù)斷中含硒化合物的抗氧化活性的研究還不多見［2］．我國72%的地區(qū)都缺硒［3］，微量元素硒缺乏會引起多種疾病，如克山病、大骨節(jié)病等，人體補充硒可以達到防癌、抗癌的作用［4－5］;而續(xù)斷有很高的藥用價值，含有皂苷類(20 多種)［6］、多糖類［7］、生物堿類［8］、揮發(fā)油類(40 多種)［9］等多種化合物，其提取物具有促進骨的愈合［10］、免疫調節(jié)、抗維生素E 缺乏［11］、抑制金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等作用［12］，臨床上用于腰膝酸軟、肢節(jié)痿痹、跌打損傷、損筋折股、胎動漏紅、血崩下血以及遺精、帶下、癰疽、瘡腫等癥的治療［13］．研究高硒續(xù)斷具有很強的實踐意義，有利于從富硒續(xù)斷中提取硒蛋白和硒多糖等大分子有機硒，成為新一類補硒劑產品，為有機硒藥物或保健食品的開發(fā)提供理論依據．

1 材料與方法

1．1 材料

所用材料采自湖北省恩施市的高硒續(xù)斷．將續(xù)斷先用自來水充分洗凈后，再用雙蒸水反復沖洗干凈，烘干(60℃)、粉碎(40 目)并密封保存．

1．2 主要藥品及試劑

牛血清白蛋白(上海藍季科技發(fā)展有限公司);硒標準溶液(100 μg/mL)(中國計量科學研究院);考馬斯亮藍G－250 試劑;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銨、磷酸均為分析純(天津市福晨化學試劑廠);無水乙醇、鹽酸均為優(yōu)級純(武漢市中天化工有限責任公司);過氧化氫和硝酸分別為分析純和優(yōu)級純(國藥集團化學試劑有限公司);硼氫化鉀，分析純(西亞試劑);氫氧化鉀，分析純(天津市光復科技發(fā)展有限公司)．還有75%乙醇、無水乙醇、氯仿、異戊醇、石油醚、苯酚、草酸、氯化鈉、50 mmol/L Tris－HCl 緩沖液(pH 值8．2)、2．5 mol/L PBS 緩沖液(pH 值6．6)、0．2 moL/L PBS 緩沖液(pH 值7．4)、3 mmol/L 鄰苯三酚(10 mmol/L HCl 配制)、0．75 mmol/L 鄰二氮菲無水乙醇溶液、0．75 mmoL/L FeSO4溶液、10%三氯乙酸(TCA)溶液、1% K3Fe(CN)6溶液、0．1% FeCl3溶液、0．015%H2O2溶液、維生素C 等，所有試劑均為分析純，所用水為雙重蒸餾水．

1．3 主要儀器設備

GZX－9140 MBE 型數顯鼓風干燥箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司);DFY－500 型500 g 搖擺式高速中藥粉碎機(上海弘荃機械廠);雙重蒸餾水器(SZ－93)(上海亞榮生化公司);BS 124S 型電子天平(上海天平廠);S21－3 型磁力攪拌器(上海司樂儀器廠);LXJ－ⅡB 型低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠);TU－1810 型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);微波消解系統(tǒng)(ETHOSPLUS)(意大利MILESTONE 公司);AFS－930d 原子熒光光度計(北京海光儀器有限公司);RE－52 型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器)．

1．4 方法

1．4．1 不同溶劑提取含硒蛋白質的方法及質量分數檢測 參照姚敏［14］在富硒靈芝中不同種類蛋白質的提取方法，對續(xù)斷中不同種類的含硒蛋白進行了提取、分離與測定．

1)水溶性含硒蛋白質的提取及檢測．準確稱取續(xù)斷粉2 g，在磁力攪拌器上石油醚脫脂后，將沉淀用雙蒸水50 mL，常溫下攪拌提取4 h，5 000 r/min 離心20 min，得水提物，加(NH4)2SO4至飽和，透析，將蛋白質轉出用雙蒸水定容至100 mL 比色．

2)鹽溶性含硒蛋白質的提取及檢測．在水溶性蛋白硒提取后的殘渣中加0．5 mol/L NaCl 溶液50 mL，常溫下攪拌提取4 h，5 000 r/min 離心20 min，得鹽提物，加(NH4)2SO4至飽和，透析，將蛋白質轉出用0．5 mol/L NaCl 溶液定容至100 mL 比色．

3)醇溶性含硒蛋白質的提取檢測．在鹽溶性蛋白硒提取后的殘渣中加75%乙醇50 mL，常溫下攪拌提取4 h，5 000 r/min 離心20 min，得提取物，加1 倍量的雙重蒸餾水，4℃靜置過夜．4℃離心15 min(轉速同上)，取沉淀，用75%乙醇定容至100 mL 比色．

4)堿溶性含硒蛋白質的提取及檢測．在醇溶性蛋白硒提取后的殘渣中加0．1 mol/L NaOH 溶液50 mL，常溫下攪拌提取4 h，5 000 r/min 離心20 min，得提取物，將上清液中和至pH7．0，然后透析，方法同上，將蛋白質轉出，0．1 mol/L NaOH 溶液定容至100 mL 比色．

1．4．2 硒多糖的提取及含量測定 準確稱取續(xù)斷粉2 g，在磁力攪拌器上石油醚脫脂后，加入40 mL 蒸餾水，90℃保溫3 h，4℃離心15 min(轉速同上)的上清液，然后用氯仿－異戊醇(24 ∶1)除去蛋白質，氯仿－異戊醇溶液與提取液體積比為1 ∶1，用分液漏斗分離出蛋白質，倒出上清液，在上清液加入1 倍量的95%的乙醇后將其放入冰箱中靜置過夜，離心得到多糖沉淀，用85%乙醇洗滌3 次，再將沉淀用雙蒸水溶解定容到100 mL．

1．4．3 蛋白質含量的測定 考馬斯亮藍法測定蛋白質含量［15］．用牛血清蛋白做標準曲線，測定蛋白質量分數．

1．4．4 多糖含量的測定 采用苯酚—硫酸比色法［16］．用葡萄糖標準溶液先作標準曲線，然后測定多糖的質量分數．

1．4．5 含硒化合物清除超氧陰離子的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定清除超氧陰離子的能力，參照文獻［17－18］利用鄰苯三酚自氧化產生;清除超氧陰離子能力計算公式為:

式中:△D1/△t為鄰苯三酚自氧化時反應速率，△D2/△t為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化時反應速率．

1．4．6 含硒化合物清除羥自由基的方法 參照文獻［19－20］并略作改進，利用Fenton 反應產生·OH．在試管中依次加入0．75 moL/L 鄰二氮菲無水乙醇溶液1 mL、pH 值為7．4 的PBS 緩沖液2 mL、雙蒸水1 L、0．75 mmoL/L FeSO4溶液1 mL、H2O21 mL，置于37℃水浴中反應60 min，以體積比為1 ∶2 的緩沖液和雙蒸水作參比液，在536 nm 波長處測其吸光度D損．按下列公式計算清除率．

式中:D樣、D未、D損分別為加入樣品、不加樣品和H2O2體系的吸光度值．

1．4．7 含硒化合物還原力的測定 對參考文獻［21－22］的方法稍加改進，在試管中加入不同體積分數的樣品液2．0mL，2．5moL/L 的PBS 緩沖液2．0mL，1% K3Fe(CN)6溶液2．0mL，50℃水浴加熱20min，快速冷卻后，加入10%TCA 溶液2．0 mL，混勻，3 000 r/min 離心10 min，取上清液2．0 mL，依次加入雙蒸水2．0 mL、0．1%FeCl3溶液0．4 mL，充分混勻，靜置10 min，以雙蒸水作參比，在700 nm 下測定其吸光度D，D值越大表示還原能力越強，以樣品濃度對作圖．

1．4．8 含硒化合物中硒含量的測定 參考文獻中含硒化合物的消化方法［23］和原子熒光光度法［24］測定富硒續(xù)斷各種提取物中硒含量，每個樣品做兩次平行．

2 結果與分析

2．1 續(xù)斷中不同種類蛋白質的質量分數檢測結果

考馬斯亮藍G－250 染色法測定蛋白質含量，標準曲線y=0．006 6x+0．011 5，R2=0．998 5．由此可以計算出提取的不同種類蛋白質的質量分數如圖1 所示．

圖1 不同溶劑提取物中蛋白質的含量的比較Fig．1 Protein content of different solvents extraction

由圖1 可知:續(xù)斷不同溶劑提取物中都還有一定量的蛋白質，含量多少的排列順序依次是:堿溶性蛋白質＞水溶性蛋白質＞鹽溶性蛋白質＞醇溶性蛋白質．

2．2 多糖含量測定

苯酚－硫酸法測定多糖質量分數，標準曲線y=0.007 3x－0．006 7，R2=0．999 3．由此可以計算續(xù)斷樣品的多糖含量為1．677 mg/g．

2．3 各種提取物中硒含量的測定結果

硒的標準溶液做得標準曲線:I= 395．228 4C+1.806 1，式中:C為測得硒的質量分數值，單位:μg/g;I為熒光度值．續(xù)斷原樣中硒的含量為1．538 μg/g．由此計算出續(xù)斷各個樣品中的含硒量．

由圖2 可知:總蛋白中的含硒量大于多糖硒;四種溶劑提取蛋白質中硒含量的順序為:醇溶性硒蛋白＞鹽溶性硒蛋白＞堿溶性硒蛋白＞水溶性硒蛋白．總的來說續(xù)斷中的硒主要存在蛋白質中，尤其是醇溶性蛋白含硒量最高．

圖2 各種提取物中硒含量的比較Fig．2 Selenium content of different solvents extraction

2．4 不同溶劑提取物對超氧自由基的清除率的測定

鄰苯三酚自氧化測定結果如圖3，不同溶劑提取的蛋白質和多糖對超氧陰離子清除能力不同，續(xù)斷堿提物對超氧陰離子自由基沒有清除能力，其它提取物對超氧陰離子自由基的都有一定的清除能力，其中醇提物清除力最強，鹽提物相對的最弱．多糖具有較強的清除超氧陰離子作用．

圖3 不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基的清除率比較Fig．3 The clearance rate of superoxide anion from different extracts

2．5 不同溶劑提取物對羥自由基的清除率的測定

Fenton 反應中吸光度值D損的測定結果如圖4，續(xù)斷不同溶劑提取液對羥自由基都有清除能力．按照清除能力的強弱排列其順序為:多糖＞水提物＞鹽提物＞醇提物＞堿提物．

圖4 不同溶劑提取物對的羥自由基清除率比較Fig．4 The clearance rate of Hydroxyl free radicals from different extracts

2．6 不同溶劑提取物還原力測定結果

在還原能力測定反應體系中，不同溶劑提取物溶液可以提供電子，使Fe3+還原成Fe2+，并與自由基形成較穩(wěn)定的物質，中斷自氧化連鎖反應引起體系吸光度增加，表現出抗氧化作用潛力．所得提取物的還原能力比較如圖5 所示．由圖5 可知，還原能力大小表現為:堿提物＞水提物＞鹽提物＞多糖＞醇提物．

3 結論與討論

本文分別提取了續(xù)斷中四種溶劑硒蛋白、總可溶性蛋白及硒多糖，并測定了以上各種提取物的含量，及各組分中硒的含量，除此之外本文還測定了各提取物清除超氧陰離子自由基、清除羥自由基的能力，以及它們各自的還原力．分析結果得知:四種溶劑提取物中均含有一定量的硒蛋白，其含量相對來說也比較平均，總可溶性蛋白質的含量達到1．314 mg/g，蛋白質含量最低的是醇溶性蛋白，含量為0．258 mg/g，四種可溶性蛋白質含量排列順序為:堿溶性蛋白質＞水溶性蛋白質＞鹽溶性蛋白質＞醇溶性蛋白質．續(xù)斷中多糖的含量為1．677 mg/g，比總可溶蛋白含量高．續(xù)斷中硒的含量為1.538 μg/g，蛋白質、多糖中都賦存一定量的硒，蛋白硒是續(xù)斷中硒的主要賦存形態(tài)．四種溶劑提取物中醇溶性硒蛋白的含量最高，它的含量可達總可溶性蛋白的42.76%．按照相同質量樣品中結合硒量得多少，可以得出含硒量多少的順序為:總蛋白硒＞多糖結合硒;醇溶性硒蛋白＞鹽溶性硒蛋白＞堿溶性硒蛋白＞水溶性硒蛋白．

恩施續(xù)斷中各種提取物都有一定的清除超氧陰離子和羥自由基的能力，且不同溶劑提取物的清除率都不同，其中醇溶性提取物的清除率超氧自由基的能力最好，達到了22．642%，堿溶性提取物清除超氧自由基的能力最弱;硒多糖清除羥自由基的能力最強，清除率為85．42%．續(xù)斷不同提取物都具有一定的還原力，還原力的強弱順序為:堿提物＞水提物＞鹽提物＞多糖＞醇提物，還原力最強的為堿溶性硒蛋白，其吸光度值達到了0．801．可見恩施續(xù)斷中微量元素硒的含量相對較高，而且總的來說續(xù)斷中各種提取物的清除自由基的能力較強．

研究表明，我國缺硒地方還很多，因缺硒引起的疾病如克山病也存在一些，研究續(xù)斷中硒的賦存及含量有利于日后從續(xù)斷中提取硒作為缺硒人群的硒補充劑，硒對預防心血管疾病也有重要作用，有利于維持心血管系統(tǒng)正常的結構與功能，預防動脈硬化與冠心病的出現，能維持機體的正常血壓．硒的生這些理作用也可用于保健品，有助于人們的健康．硒的抗衰老作用也日益受到人們的重視，這一作用可以將硒應用到美容產品中，起到一定的抗皺抗衰老的作用．目前越來越多的研究表明大量的自由基存在危害人們的健康，它是多種疾病的誘因，因此清除自由基刻不容緩，在眾多的合成抗氧化劑在市場上流通的情況下，人們越來越重視安全、科學養(yǎng)生，從續(xù)斷中提取天然抗氧化劑將會是一種更加綠色、安全的方法．可見本研究是具有實際意義的，它為人們的健康有很大的幫助，今后能夠應用于生產還需要更進一步的研究，希望今后有更多的人能夠在這個領域上做更進一步的研究．

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