基于SCoT 標(biāo)記的飼用燕麥品種遺傳結(jié)構(gòu)及指紋圖譜分析

李進(jìn) ，陳仕勇 ，趙旭 ，田浩琦 ，陳智華 ，周青平

（1. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041；2. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都610041；3. 動(dòng)物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

燕麥（Avena sativa）為禾本科（Poaceae）燕麥屬（Avena）一年生草本植物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等優(yōu)良特性和很高的營養(yǎng)及保健價(jià)值［1］，因此成為重要的糧飼兼用作物。燕麥主要分布在北半球的溫帶地區(qū)，國內(nèi)主要種植省區(qū)為河北、內(nèi)蒙古、山西，其次是青海、甘肅、寧夏、吉林、云南及四川等［2］。根據(jù)燕麥籽粒外稃的形狀可以劃分為皮燕麥（A. stativa）和裸燕麥（A. nuda），其中皮燕麥主要為飼用。隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，其對優(yōu)質(zhì)粗飼料的需求越來越大，而燕麥飼草已經(jīng)成為牛羊養(yǎng)殖行業(yè)最重要的優(yōu)質(zhì)粗飼料來源之一。在我國的青藏高原高寒牧區(qū)，燕麥青干草更是牦牛和藏羊最重要的冬春補(bǔ)飼飼草種類，目前已成為高寒地區(qū)冷季補(bǔ)飼的主要飼草。

選擇適宜的品種是不同地區(qū)進(jìn)行燕麥飼草生產(chǎn)最重要的環(huán)節(jié)。目前生產(chǎn)中應(yīng)用的飼用燕麥品種有國產(chǎn)品種和進(jìn)口品種，如在青藏高原地區(qū)種植的品種包括青引系列、隴燕系列及白燕系列等國產(chǎn)品種，也有包括科納、夢龍、貝勒、哈維等國外品種。已有的引種以及品比試驗(yàn)結(jié)果表明不同燕麥品種在不同的區(qū)域表現(xiàn)了不同的特點(diǎn)和生產(chǎn)潛力［3?4］，但是對這些品種資源的遺傳基礎(chǔ)信息了解較少。同時(shí)，如何確保品種的真實(shí)性以及利用現(xiàn)有品種資源進(jìn)行下一步的材料創(chuàng)制及新品種選育等都有待進(jìn)一步研究。

目前國內(nèi)外對于燕麥的研究主要集中在栽培技術(shù)［5?6］、抗性生理［7?8］、遺傳育種［9?10］等方面。而針對現(xiàn)有品種遺傳親緣關(guān)系、品種鑒定方面的研究還較少?；诖既艿鞍讟?biāo)記的研究初步揭示了青引1 號(hào)等15 個(gè)燕麥品種之間的親緣關(guān)系，但由于其標(biāo)記位點(diǎn)較少，部分品種間并不能完全區(qū)分［10］。采用基于PCR 技術(shù)的分子標(biāo)記已經(jīng)成為種質(zhì)資源遺傳親緣關(guān)系和指紋圖譜等研究的重要手段。現(xiàn)已有多種分子標(biāo)記對不同燕麥材料進(jìn)行了研究，如內(nèi)部簡單重復(fù)序列（inter?simple sequence repeats，ISSR）［11］、DNA 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）［12］、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）［13］等分子標(biāo)記技術(shù)運(yùn)用在燕麥屬植物遺傳分析中。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記（start condon targeted polymorphism，SCoT）是一種基于翻譯起始位點(diǎn)的目的基因標(biāo)記，自Collard 等［14］開發(fā)了SCoT 分子標(biāo)記至今，已有大量研究將其用于植物遺傳多樣性分析，如優(yōu)良牧草資源紫花苜蓿（Medicago sativa）［15］、鴨茅（Dactylis glomerata）［16］等，但在燕麥屬植物中的應(yīng)用還未見報(bào)道。本研究首次利用SCoT 技術(shù)對目前國內(nèi)主要種植的飼用燕麥品種進(jìn)行了遺傳親緣關(guān)系分析，比較了不同燕麥品種之間的遺傳差異，篩選出特異的標(biāo)記構(gòu)建了供試燕麥品種的指紋圖譜，從分子水平上為品種鑒定、品種保護(hù)及雜交育種等資源創(chuàng)制工作提供了重要的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料選用了36 個(gè)飼用燕麥品種，其中國內(nèi)選育的品種7 個(gè)，地方品種1 個(gè)，其余28 個(gè)均為國外引進(jìn)品種，所有材料來源信息見表1。2019 年10 月將供試燕麥種子播種于花盆，并置于植物生長培育溫室中。

表1 試驗(yàn)材料及來源Table 1 Materials used in the study

1.2 指標(biāo)及測定方法

1.2.1 DNA 提取 每個(gè)品種采集20 株的鮮嫩葉片混合后，采用植物基因組提取試劑盒DP305（北京天根生化）提取品種DNA，用NanoDrop-Lite（Thermo Scientific，美國）測定其濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，將提取完成且符合試驗(yàn)要求的模板DNA 保存在?20 ℃冰箱，使用前將其稀釋為10 ng·μL?1，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SCoT 引物篩選 本研究選用 Collard 等［14］（SCoT1～SCoT36）及 Luo 等［17］（SCoT37～SCoT80）開發(fā)的SCoT 引物，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。選取青引1 號(hào)、青引2 號(hào)、蘇聯(lián)燕麥和青燕1 號(hào)4 個(gè)品種對80 個(gè)SCoT 引物進(jìn)行篩選，從中選出帶型容易識(shí)別且多態(tài)性較好的引物并確定對應(yīng)的退火溫度，用于進(jìn)一步的PCR 擴(kuò)增。

1.2.3 SCoT?PCR 擴(kuò)增 本試驗(yàn)的 PCR 反應(yīng)體系為 20 μL：包含 2 μL 模板 DNA（10 ng·μL?1）、2 μL 引物（10 μmol·L?1）、9 μL 2×Es Taq MasterMix（北京康為世紀(jì)生物）和 7 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在 BIO?RAD T100 Termal Cycler PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；退火1 min（48～54 ℃）；72 ℃延伸1.5 min；反應(yīng)共34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后采用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察并保存各個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在擴(kuò)增結(jié)果中，選取條帶清晰且多態(tài)性好的引物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在同一遷移位置上，有條帶記為1，無條帶記為0，建立1，0 矩陣。參考劉新龍等［18］的方法對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小進(jìn)行估算，用以構(gòu)建36 個(gè)燕麥品種的DNA 指紋圖譜。利用軟件DCFA 1.1 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入POPGENE 1.32 中計(jì)算多態(tài)性條帶百分比（percentage of polymorphic bands，PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）和 Shannon’s 多樣性指數(shù)（I）。利用NTSYS-pc 2.10e 軟件進(jìn)行品種間的DICE 遺傳相似性系數(shù)（genetic similarity coefficients，GS）分析，并利用非加權(quán)組平均法（unweighted pair group method with arithmetic average，UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建燕麥品種聚類樹狀圖。利用軟件Structure 2.3.4 分析燕麥品種的群體結(jié)構(gòu)，將群體數(shù)K值設(shè)置為1～20，每個(gè)參數(shù)運(yùn)行5 次，每次運(yùn)行的burn-in time 設(shè)置為100000，重復(fù)次數(shù)為50000。計(jì)算結(jié)果上傳至Structure Harvester（http：//taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/）網(wǎng)頁進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果中的LnP（K）或ΔK值來確定最優(yōu)分群數(shù)K，最終構(gòu)建36 個(gè)燕麥品種的群體結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT 標(biāo)記多態(tài)性分析

利用15 個(gè)SCoT 引物共擴(kuò)增出146 條清晰條帶，擴(kuò)增結(jié)果如表2 所示，平均每個(gè)引物擴(kuò)增9.7 條，變幅為6（SCoT80）～14 條（SCoT75）；多態(tài)性條帶共 96 條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶為 6.4 條，變幅為 3（SCoT37）～10 條（SCoT50），多態(tài)性比率（PPB）為 65.75%；Ne變異范圍為 1.15～1.80，平均為 1.46；H范圍在 0.10～0.44，平均為0.27；I范圍在0.15～0.62，平均為0.38。這說明了SCoT 標(biāo)記對燕麥屬植物具有良好的通用性與多態(tài)性，能夠用于燕麥品種的遺傳變異分析（圖1）。

表2 15 個(gè)SCoT 引物擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The amplified results of 15 SCoT primers

圖1 引物SCoT48 對燕麥品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified results of SCoT48 primer

2.2 燕麥品種指紋圖譜構(gòu)建

通過對15 個(gè)SCoT 引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，綜合考慮引物組合數(shù)量和重復(fù)性的高低，最終選取可將36 個(gè)燕麥品種完全區(qū)分開的4 個(gè)引物組合，即選用了SCoT48、SCoT50、SCoT53、SCoT77 用于構(gòu)建供試燕麥品種的指紋圖譜（圖2）。該指紋圖譜反映了供試的36 個(gè)供試燕麥品種具有唯一的擴(kuò)增譜帶，通過該圖譜能準(zhǔn)確、快速地鑒定這36 個(gè)品種的燕麥，也可以為相關(guān)品種和材料的鑒定提供參考。

圖2 供試燕麥品種指紋圖譜Fig.2 Fingerprinting of 36 oat varieties

2.3 遺傳相似系數(shù)和聚類分析

36 份供試品種間的遺傳相似性系數(shù)（GS）在0.7596～0.9507，平均值為0.8473；其中同為引自美國的品種莫妮卡與海神的遺傳相似系數(shù)最高，親緣關(guān)系最近；國內(nèi)育成品種青燕1 號(hào)與加拿大品種貝勒遺傳相似系數(shù)最低，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，來自中國、美國、加拿大的燕麥品種間遺傳相似系數(shù)變幅分別為0.7980～0.9121、0.7945～0.9507、0.7742～0.9244，平均值分別為0.8576、0.8517、0.8456，表明來自加拿大的品種的遺傳背景相對較寬。

基于DICE 遺傳相似系數(shù)構(gòu)建了各供試燕麥品種的UPGMA 聚類樹狀圖（圖3）。如圖顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.836 處大致可將所有品種劃分為4 個(gè)類群，其中第Ⅰ類群由來自丹麥的丹麥444 與來自青海的青燕1 號(hào)組成；第Ⅱ類群所包含的品種數(shù)最多，共30 個(gè)，占總數(shù)的83.3%；其中第Ⅱ類群在遺傳相似系數(shù)為0.866 處又能劃分為7 個(gè)亞類。第ⅰ亞類共有10 個(gè)品種，國內(nèi)品種有5 個(gè)，其余為來源于挪威、加拿大和美國的5 個(gè)引進(jìn)品種；青引1號(hào)與3 個(gè)來自加拿大的品種聚為第ⅱ亞類；第?！嗩惥蓢獾囊M(jìn)品種組成；來自甘肅的隴燕3 號(hào)單獨(dú)聚為第ⅶ亞類。第Ⅲ類群包含3 個(gè)品種，包括青引2 號(hào)、青莜3 號(hào)和阿壩燕麥，均為國內(nèi)審定登記品種；來自俄羅斯的蘇聯(lián)燕麥與其他品種燕麥的遺傳距離最遠(yuǎn)，單獨(dú)劃為第Ⅳ類（100%支持率）。

圖3 SCoT 標(biāo)記對36 份燕麥品種親緣關(guān)系聚類分析Fig.3 Dendrogram of the 36 oat varieties based on SCoT markers using UPGMA method

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

利用Structure Harvester 網(wǎng)頁的分析結(jié)果，繪制K值曲線圖（圖4），如圖所示，隨著K值的增大，LnP（K）呈上升趨勢，未出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)，無法確定最優(yōu)分群數(shù)K。因而通過ΔK確定供試材料的群體數(shù)，當(dāng)ΔK達(dá)到最大時(shí)，對應(yīng)的K值為4，于是將供試材料劃分為4個(gè)類群，并通過Structure 繪制36 個(gè)燕麥品種的群體結(jié)構(gòu)圖（圖5）。4 個(gè)類群中，S1類群所包含的品種數(shù)最多，為14 個(gè)，且國內(nèi)大部分品種分布在S1類群中；S2類群除隴燕3 號(hào)以外皆為國外品種；S3類群包含品種數(shù)最少，僅有5 個(gè)，且全為國外引進(jìn)品種；S4類群僅青引1 號(hào)一個(gè)國內(nèi)品種。

圖4 基于Structure 分析的K 值曲線Fig.4 Curve diagram of K value based on Structure

圖5 36 份燕麥材料群體結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Population genetic structure of 36 oat varieties

參照劉麗華等［19］將Q值＜0.6 的品種視為混合來源，Q值＞0.6 的品種視為來源單一。結(jié)果顯示，28 個(gè)國外引進(jìn)品種中有19 個(gè)品種（67.9%）來源單一，另外有9 個(gè)品種（32.1%）擁有混合來源；而8 個(gè)國內(nèi)育成品種中，6 個(gè)品種（75%）來源單一，僅有2 個(gè)品種（25%）具有混合來源。

3 討論

3.1 燕麥品種遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是種質(zhì)資源研究中的重要內(nèi)容，同時(shí)也是燕麥遺傳育種的重要依據(jù)。傳統(tǒng)育種常常以生理生化指標(biāo)作為依據(jù)，這很大程度上依賴于育種家的經(jīng)驗(yàn)與機(jī)遇，存在著極大的盲目性和不可預(yù)測性，而利用分子生物育種技術(shù)能顯著提高育種效率［20］。分子標(biāo)記技術(shù)作為一種輔助育種手段，可以對種質(zhì)資源與雜交后代進(jìn)行基因鑒定，從而提高育種的效率［21］。

目前國內(nèi)外已有多種分子標(biāo)記在燕麥種質(zhì)資源遺傳評價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建及QTLs 定位中應(yīng)用。劉歡等［22］利用AFLP 標(biāo)記對來自不同國家的燕麥進(jìn)行遺傳多樣性研究，得到的多態(tài)性條帶比率為69%。Li 等［23］利用新開發(fā)的SSR 標(biāo)記建立了燕麥的遺傳圖譜，并揭示品種間的多態(tài)性帶比率為57%。相較于其他分子標(biāo)記，SCoT 標(biāo)記具有易開發(fā)、成本低、重復(fù)性高等技術(shù)優(yōu)勢，本研究首次將SCoT 標(biāo)記應(yīng)用于燕麥種質(zhì)資源研究中。在篩選的15 個(gè)SCoT 引物中共擴(kuò)增出146 條條帶，多態(tài)性條帶96 條，多態(tài)性帶比率為65.75%。蔣林峰等［16］采用SCoT 標(biāo)記對鴨茅種質(zhì)資源的檢測中發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性條帶比率為79.55%。熊發(fā)前等［24］對花生（Arachis hypogaea）栽培種質(zhì)的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性條帶比率為33.84%；韓國輝等［25］對柑橘（Citrus）的檢測結(jié)果顯示多態(tài)性帶比率為54.8%。這都說明SCoT 標(biāo)記對燕麥種質(zhì)資源具有較好的擴(kuò)增效果，能夠在燕麥種質(zhì)中檢測出較豐富的遺傳多態(tài)性，可以用于燕麥種質(zhì)資源品種鑒定、遺傳多樣性等分析。

3.2 燕麥品種指紋圖譜的構(gòu)建

隨著國內(nèi)對燕麥飼草需求的加大，國內(nèi)品種數(shù)量及質(zhì)量都難以滿足其需求，近年來進(jìn)口燕麥品種備受種植戶的青睞。但是進(jìn)口的品種也存在品種來源不清，品種名翻譯混亂，甚至有同種異名的情況，所以開展品種的準(zhǔn)確鑒定及指紋圖譜構(gòu)建顯得很有必要。本試驗(yàn)采用15 個(gè)SCoT 引物對36 個(gè)國內(nèi)外常見的飼用燕麥品種的遺傳變異進(jìn)行研究，揭示了供試品種的基因多樣性指數(shù)在0.10～0.44，Shannon’s 指數(shù)在0.15～0.62，表明SCoT 標(biāo)記技術(shù)在燕麥品種鑒定及指紋圖譜構(gòu)建中具有較大的潛力。最終，本研究利用4 個(gè)SCoT 引物對36 個(gè)燕麥品種進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，所有供試品種能夠完全區(qū)分開，這也表明SCoT48、SCoT50、SCoT53、SCoT77 這4 個(gè)引物是進(jìn)行燕麥種質(zhì)鑒定的核心引物。蔣林峰等［26］利用SCoT23 與5 個(gè)SSR 引物組合，構(gòu)建了我國主栽的21 個(gè)鴨茅品種的DNA 指紋圖譜，這也表明不同的SCoT 標(biāo)記在不同物種中的擴(kuò)增效率是不同的，多種分子標(biāo)記組合在種質(zhì)鑒定中的效率可能更高。目前燕麥品種的指紋圖譜構(gòu)建等工作還較落后，為了更好地開展燕麥種質(zhì)的創(chuàng)新及新品種的選育應(yīng)盡快開展多種高效分子標(biāo)記的篩選，并建立燕麥品種指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 燕麥品種遺傳親緣關(guān)系及群體結(jié)構(gòu)分析

本研究基于遺傳相似系數(shù)構(gòu)建了目前國內(nèi)主要種植利用的飼用燕麥品種的聚類關(guān)系，揭示了供試品種之間的遺傳親緣關(guān)系，可以為燕麥雜交育種中的親本選配提供重要的參考。供試的36 個(gè)飼用燕麥品種間的遺傳相似性系數(shù)在0.7596～0.9507，平均值為0.8473，遺傳相似性越高，遺傳親緣關(guān)系越近。在目前國內(nèi)選育登記的幾個(gè)品種中，蘇聯(lián)燕麥（即青海甜燕麥）單獨(dú)聚為一類，表明蘇聯(lián)燕麥的遺傳背景與其他品種存在較大的差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以作為雜交的候選親本。青燕1 號(hào)與丹麥444（即青海444）遺傳相似系數(shù)最高（0.8879），二者聚為一類，二者均為褐色稃皮，與醇溶蛋白A?PAGE 電泳分析結(jié)果一致［9］。青引1 號(hào)與隴燕4 號(hào)關(guān)系較近，青引2 號(hào)與隴燕5 號(hào)關(guān)系較近，這也再次反映了國內(nèi)燕麥的遺傳背景相對狹窄。在5 個(gè)隴燕系列育成品種中，隴燕3 號(hào)與其他品種差異較大，可能是由于隴燕3 號(hào)的母本丹麥444 和父本Fyris 均來自歐洲；而隴燕1 號(hào)和隴燕4 號(hào)、隴燕5 號(hào)和隴燕1 號(hào)、隴燕2 號(hào)與加拿大的哈維之間的親緣關(guān)系較近，這與它們來源的親本相似有關(guān)，如它們的母本多選用甘肅黃燕麥等。而來自美國和加拿大的進(jìn)口品種中，莫妮卡與海神，貝勒II 與伽利略等品種之間的遺傳相似系數(shù)在0.94 以上，在引種利用中應(yīng)該盡量避開同時(shí)引種。此外，青莜3 號(hào)作為供試材料中唯一的裸燕麥，聚類分析將其與國內(nèi)品種聚為一類，并沒有與其他皮燕麥品種分開，可能是由于燕麥育種過程中選用皮、裸雜交，使裸燕麥與皮燕麥部分品種之間親緣關(guān)系較近，這也與齊冰潔等［27］的研究結(jié)果相似。

群體結(jié)構(gòu)分析顯示，供試材料大體上分為4 個(gè)類群，其中國外品種均勻地分布在4 個(gè)類群中，而國內(nèi)的8 個(gè)育成品種及地方品種中，7 個(gè)品種分布在S1類群，1 個(gè)分布在其他類群，這也說明國內(nèi)品種分布集中，品種間親緣關(guān)系較近。且國內(nèi)的6 個(gè)品種（75%）來源單一，僅青燕1 號(hào)與隴燕3 號(hào)具有混合來源，說明國內(nèi)燕麥品種遺傳結(jié)構(gòu)較單一，多樣性不夠豐富，這與聚類分析結(jié)果基本一致。劉歡等［11］研究發(fā)現(xiàn)我國皮燕麥遺傳相似性系數(shù)極高，種間差異小。沈國偉等［28］對中加燕麥進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示，來自中國的35 個(gè)燕麥品種中，僅有18.75%擁有混合來源。這都表明了目前國內(nèi)利用的燕麥品種的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，多樣性較低、遺傳結(jié)構(gòu)單一，所以亟須加強(qiáng)國內(nèi)燕麥品種的發(fā)掘，并開展科學(xué)、合理的燕麥引種及雜交等新種質(zhì)的創(chuàng)制。此外，燕麥的常規(guī)雜交也應(yīng)與生物技術(shù)、基因編輯等手段相結(jié)合，盡快構(gòu)建國內(nèi)燕麥的生物育種體系。