老年哮喘合并肺炎克雷伯菌感染患者毒力基因與病情嚴重程度的相關(guān)性研究*

郝超國，平 慧，郭洪海，師旭光

1.邯鄲市人民醫(yī)院檢驗科，河北邯鄲 056001；2.邯鄲市中心醫(yī)院檢驗科，河北邯鄲 056000；3.邯鄲市第一醫(yī)院檢驗科，河北邯鄲 056002

肺炎克雷伯菌(Kpn)屬革蘭陰性菌，在醫(yī)院感染致病菌中位居第二，僅次于大腸埃希菌，其在腸道、呼吸道中可引起泌尿系統(tǒng)、呼吸道感染，具有較強的毒力，致病性強，易在醫(yī)院暴發(fā)流行，危害嚴重[1-3]。Kpn感染者往往入院率、住院花費增加，住院時間延長，呼吸道感染Kpn是入住重癥監(jiān)護病房的危險因素[4]，但Kpn的致病機制尚不明確。有研究顯示，Kpn毒力基因種類不同，菌株黏性、抗白細胞吞噬、侵襲等因素不同，疾病狀況不同[5-6]。但毒力基因與疾病嚴重程度之間關(guān)系鮮見相關(guān)研究。因此，本研究以呼吸道疾病哮喘病為研究疾病，探討老年哮喘合并Kpn感染患者毒力基因與疾病嚴重程度關(guān)系，為臨床提供一定依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2020年7月邯鄲市人民醫(yī)院收治的373例哮喘患者作為觀察組，其中男187例，女186例；年齡61～82歲，平均(70.58±6.86)歲。納入標準：(1)符合2016年中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組制定的支氣管哮喘診斷標準[7]；(2)年齡≥60歲；(3)首次確診且未經(jīng)治療；(4)資料完整。排除標準：(1)合并其他細菌感染疾?。?2)近1周服用抗菌藥物；(3)有家族疾病史。選取同期390例體檢健康者作為對照組，其中男195例，女195例；年齡60～83歲，平均(71.08±8.47)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)邯鄲市人民醫(yī)院倫理委員會審核并通過。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定 收集所有受試對象痰液，細菌分離全程采用無菌操作，經(jīng)DL-96Ⅱ細菌鑒定系統(tǒng)(珠海迪爾生物工程有限公司)鑒定為Kpn，并符合醫(yī)院感染診斷標準[8]。

1.2.2PCR檢測毒力基因情況 對所有哮喘合并Kpn感染陽性患者進行毒力基因檢測，復蘇菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平板，于35 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜后，挑取適量菌落置于裂解液中，經(jīng)煮沸法提取總DNA，用于毒力基因wcaG、rmpA、rmpA2、magA、fimH、mrkD、uge、wabG、aero、iucB、iutA、iroNB、ybtA、kfuBC、ureA、allS的PCR反應。50 μL PCR反應體系：Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 18 μL。反應條件：95 ℃ 預變性3 min，95 ℃變性 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。參考文獻[9]設(shè)計毒力基因引物，引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成。PCR產(chǎn)物采用0.15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，100 V恒定電壓下電泳100 min后，采用Gel DocTMXR及凝膠成像儀(美國伯樂公司)觀察結(jié)果。

1.2.3疾病嚴重程度 參考《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》中關(guān)于哮喘急性發(fā)作時疾病嚴重程度分級標準[7]。輕度：活動時氣短，講話可連續(xù)，肺部散在哮鳴音，動脈血氧分壓(PaO2)正常、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)≤45 mm Hg；中度：稍活動即出現(xiàn)氣短現(xiàn)象，講話時斷續(xù)，肺部有響亮、彌散哮鳴音，PaO2≥60 mm Hg、PaCO2≤45 mm Hg；重度：休息時即出現(xiàn)氣短，講話單字，焦慮、煩躁，有三凹征，肺部有響亮、彌散哮鳴音，PaO2<60 mm Hg、PaCO2>45 mm Hg；危重：不能講話，嗜睡或意識模糊，呼吸弱或無，PaO2<60 mm Hg、PaCO2>45 mm Hg、血氧飽和度≤90%。

1.3統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計學軟件SPSS25.0對數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，行χ2檢驗。采用Spearman分析毒力基因與疾病嚴重程度的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組Kpn檢出情況 觀察組檢出Kpn 175例，感染率為46.92%，對照組檢出Kpn 12例，感染率為3.08%，觀察組Kpn感染率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=198.050，P<0.001)。

2.2哮喘合并Kpn感染患者臨床分離菌株毒力基因檢出率 復蘇從175例哮喘合并Kpn感染患者痰液標本中分離的175株菌種。其中，3株菌種復蘇失敗，故檢測了172株菌種的毒力基因情況。陽性率最高的前5種毒力基因為uge(100.00%)、ureA(90.70%)、magA(88.95%)、ybtA(86.05%)、mrkD(85.47%)。見表1。

表1 哮喘合并Kpn感染患者臨床分離菌株毒力基因檢出情況

續(xù)表1 哮喘合并Kpn感染患者臨床分離菌株毒力基因檢出情況

2.3毒力基因與病情嚴重程度的相關(guān)性 172例哮喘合并Kpn感染患者中輕度102例，中度42例，重度20例，危重8例。Spearman相關(guān)分析顯示，毒力基因rmpA、rmpA2、magA與疾病嚴重程度呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 毒力基因rmpA、rmpA2、magA、fimH、wabG、aero、ybtA、ureA、allS與疾病嚴重程度的相關(guān)性

3 討 論

Kpn作為機會致病菌，是世界范圍內(nèi)最重要的醫(yī)院感染病原體之一，其易在醫(yī)院暴發(fā)流行，可引起患者多器官感染，增加死亡風險，威脅患者生命安全[10-12]。Kpn致病的原因可能是多種毒力基因的共同作用。根據(jù)類型，Kpn毒力基因可分為莢膜多糖合成和合成調(diào)控基因、菌毛合成相關(guān)基因、脂多糖相關(guān)基因、鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)基因、尿素酶相關(guān)基因。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者相比，哮喘患者Kpn感染率較高，提示可能受機體本身和環(huán)境等影響，導致哮喘患者更易受Kpn感染，且感染Kpn會加重患者病情，從而影響患者健康。

莢膜多糖合成和合成調(diào)控基因為Kpn主要致病因子，可促進生物膜生成，具有抗調(diào)理素效應，主要逃避宿主機體的免疫應答過程，增加其抗吞噬能力[13-14]。rmpA、rmpA2均作為編碼黏液表型調(diào)節(jié)因子，且二者具有高度同源性，可參與自身新陳代謝，是增強毒力的鐵載體，可與鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)基因氣桿菌素iutA等共同作用、相互促進，增強細胞黏性，加重病情[15-16]。有研究顯示，通過建立magA突變體可降低菌株血清抵抗和抗吞噬能力，存在magA的菌株侵襲性感染能力更強[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莢膜多糖合成和合成調(diào)控基因magA在Kpn菌種中攜帶率較高，rmpA、rmpA2、magA與疾病嚴重程度呈正相關(guān)(P<0.05)，提示莢膜多糖合成相關(guān)基因影響菌種生物膜合成，而不同形態(tài)的生物膜表現(xiàn)出黏附性、侵襲性、抗吞噬能力均不相同，rmpA、rmpA2、magA表達可能提高Kpn黏附性、侵襲性、提高抗吞噬能力，從而加重病情，臨床上檢測莢膜多糖合成和合成調(diào)控基因可能反映Kpn致病強度。菌毛合成相關(guān)基因影響菌株黏附性，其中黏附因子fimH可使菌毛穿過莢膜向外延伸，促進菌株黏附；脂多糖相關(guān)基因可以抵抗機體天然免疫，對宿主有較強的防御作用；鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)基因影響鐵離子的攝取，Kpn在生長代謝過程中需要鐵離子的參與，在高致病性菌種中表現(xiàn)出特異性[18-19]。本研究結(jié)果顯示，脂多糖相關(guān)基因uge、wabG在Kpn中陽性表達率較高，提示Kpn均對宿主天然免疫的作用較強，菌株之間可能差異性不強。aero、kfuBC在Kpn中可以檢測到陽性，可能受樣本量影響，鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)基因在本研究中只檢測到3種。尿素酶相關(guān)基因作為尿酸衍生物，可為Kpn生長提供碳源和氮源，尿素酶相關(guān)基因缺失株小鼠中Kpn毒力受到影響[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)，ureA、allS均在Kpn中部分出現(xiàn)陽性表達，且ureA陽性表達率較高，原因可能為ureA陽性表達為Kpn提供了生長所需碳源和氮源，從而促進Kpn生長，加重其毒力，但Kpn的毒力基因較多，更全面的毒力基因及其表達情況有待進一步研究。

綜上所述，毒力基因在哮喘合并Kpn感染患者痰液培養(yǎng)中表現(xiàn)出不同程度的表達，這些毒力基因共同影響Kpn的致病性，但莢膜多糖合成和合成調(diào)控基因在與疾病嚴重程度相關(guān)性較強，臨床上可以作為一定參考依據(jù)。