血流感染大腸埃希菌對(duì)多黏菌素耐藥機(jī)制研究

馬強(qiáng) 朱永澤 朱建俊 胡志偉 陳偉

大腸埃希菌屬于腸桿菌目埃希菌屬，是較為常見的條件致病菌之一。2018年中國CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，在血液標(biāo)本分離病原菌中，大腸埃希菌分離率高居首位，占23%[1]。多黏菌素是一類從芽胞桿菌分離獲得的脂肽類抗生素，主要作用于細(xì)菌細(xì)胞膜的脂多糖。目前，多黏菌素被國際上公認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的“最后防線”[2-4]。令人遺憾的是，多黏菌素耐藥基因已經(jīng)出現(xiàn)。2015年11月，我國學(xué)者率先報(bào)道從人與動(dòng)物腸桿菌科細(xì)菌中分離到了質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1[5]。mcr-1屬于磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族，該基因在細(xì)菌表達(dá)后可以添加磷酸氨基乙醇至脂質(zhì)A，導(dǎo)致多黏菌素對(duì)細(xì)菌脂多糖親和力降低，從而介導(dǎo)菌株對(duì)多黏菌素耐藥。本研究對(duì)兩家不同醫(yī)院分離的血流感染大腸埃希菌耐藥性進(jìn)行分析，并探討其對(duì)多黏菌素的耐藥機(jī)制，為臨床用藥及治療提供經(jīng)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株 收集2018年1月至2019年12月浙江省人民醫(yī)院和杭州市余杭區(qū)第二人民醫(yī)院門診及住院患者中分離的血流感染大腸埃希菌241株（已排除同一患者重復(fù)分離株），其中浙江省人民醫(yī)院227株，杭州市余杭區(qū)第二人民醫(yī)院14株。

1.2 藥敏試驗(yàn) 使用法國生物梅里埃公司Vitek-MS質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定菌株；藥敏試驗(yàn)采用法國生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact系統(tǒng)及革蘭陰性細(xì)菌GN13藥敏卡（批號(hào)：1101551403），根據(jù)美國抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI2018）的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果[6]。對(duì)于多黏菌素藥敏應(yīng)用微量肉湯稀釋法，根據(jù)歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）在2018年修訂的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果（S≤2 mg/L，敏感；R＞2 mg/L，耐藥）[7]。應(yīng)用WHONET 5.6軟件統(tǒng)計(jì)藥敏結(jié)果。大腸埃希菌ATCC25922為藥物敏感性質(zhì)控菌株。

1.3 多黏菌素耐藥相關(guān)基因及其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢測(cè) 采用PCR法。儀器為ABI5700型PCR擴(kuò)增儀（美國ABI Applied公司），挑取適量菌落通過煮沸法制作細(xì)菌DNA模板，相關(guān)引物見表1。PCR試劑盒（批號(hào)：ABT2231C）、Taq 酶（批號(hào)：AIF2212A）、PCR 引物及引物測(cè)序均由中國上海生工生物工程有限公司完成。PCR反應(yīng)參照朱永澤等[8]研究，具體過程及各項(xiàng)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃60 s，循環(huán)34個(gè)周期，最后72℃延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察并紀(jì)錄結(jié)果。DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，與GenBank上公布的耐藥基因進(jìn)行比對(duì)。此外其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢測(cè)按上述方法進(jìn)行，引物參考Quan等[9]研究。

表1 PCR引物序列

1.4 質(zhì)粒接合試驗(yàn) 6株攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌為供體菌，疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53為受體菌。兩種菌分別應(yīng)用MH肉湯增菌培養(yǎng)，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，將受體菌與供體菌按1:1混合，取20 μl混合液滴加于0.22 μm孔徑無菌濾膜，并將濾膜貼于MH培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h。次日，用MH肉湯沖洗濾膜并取20 μl混合液滴加于含300 mg/L疊氮鈉與4 mg/L多黏菌素的MH平板，同時(shí)單獨(dú)吸取供體菌及受體菌各20 μl接種于同一平板作為對(duì)照培養(yǎng)。接合子鑒定通過藥物敏感試驗(yàn)初步判斷，進(jìn)一步應(yīng)用PCR法檢測(cè)mcr-1基因驗(yàn)證耐藥基因是否成功轉(zhuǎn)移。

1.5 菌株多克隆序列位點(diǎn)（multilocus sequence typing，MLST）測(cè)定及進(jìn)化樹構(gòu)建 按照上述PCR程序擴(kuò)增大腸埃希菌 7 個(gè)管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA），進(jìn)一步對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將序列在MLST 數(shù)據(jù)庫（http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）進(jìn)行比對(duì)。系統(tǒng)進(jìn)化樹應(yīng)用大腸埃希菌gyrB基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用MEGA 5軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 241株血流感染大腸埃希菌藥敏結(jié)果分析 本研究顯示血液標(biāo)本中共分離6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌，分離率為2.5%。藥敏結(jié)果顯示，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星及左旋氧氟沙星耐藥率分別為69.7%、58.5%、58.1%、49.4%、43.6%、41.9%；大腸埃希菌對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、亞胺培南與美羅培南的耐藥率均為1.7%，對(duì)多黏菌素耐藥率僅為2.5%，未分離到對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株。具體藥敏結(jié)果見表2。

表2 241株血流感染大腸埃希菌藥敏結(jié)果分析[株（%）]

2.2 多黏菌素耐藥大腸埃希菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果PCR檢測(cè)顯示6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌均攜帶mcr-1耐藥基因，未發(fā)現(xiàn)其他mcr亞型基因。

2.3 多黏菌素耐藥大腸埃希菌臨床特點(diǎn) 多黏菌素耐藥大腸埃希菌導(dǎo)致血流感染患者中男2例，女4例；年齡主要分布于51～60歲，占66.7%（4/6）。所有患者都曾接受過廣譜抗生素治療，近期均沒有出國旅行史。

2.4 攜帶mcr-1耐藥基因菌株多克隆序列位點(diǎn)及其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢測(cè) 應(yīng)用大腸埃希菌7對(duì)管家基因?qū)?株攜帶mcr-1基因大腸埃希菌進(jìn)行克隆分型，測(cè)序分析結(jié)果顯示這些菌株均為不同型別，提示克隆以散發(fā)為主，未形成優(yōu)勢(shì)克隆，見表3和圖1。此外，除了攜帶mcr-1基因外，這6株菌株同時(shí)還攜帶其他β-內(nèi)酰胺酶基因，包括 blaTEM-1A、blaTEM-1B、blaOXA-1、blaCTX-M-123、blaCTX-M-14及 blaNDM-5等，具體見表3。

表3 6株攜帶mcr-1基因大腸埃希菌多克隆位點(diǎn)型別及其他β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)結(jié)果

圖1 6株攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1的大腸埃希菌根據(jù)gyrB基因構(gòu)建進(jìn)化樹圖（E1～6表示6株菌株）

2.5 質(zhì)粒接合試驗(yàn) 6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌mcr-1耐藥基因均可以成功傳遞至受體菌大腸埃希菌J53菌株中，說明該耐藥基因定位于質(zhì)粒，并可以進(jìn)行水平傳播。

3 討論

本研究顯示血液標(biāo)本中共分離6株多黏菌素耐藥大腸埃希菌，分離率為2.5%，經(jīng)PCR檢測(cè)顯示6株均攜帶mcr-1基因。本研究分離率與之前我國血流感染大腸埃希菌攜帶mcr-1基因研究（1.2%）相比有所上升[9]。值得注意的是，6株菌株均從住院患者中分離，并且都曾接受過廣譜抗生素治療。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)mcr-1分離株對(duì)碳青霉烯類耐藥率為16.7%，對(duì)第三代頭孢菌素耐藥率為66.7%，對(duì)氟喹諾酮類耐藥率為33.7%。對(duì)氨基糖苷類耐藥率為33.3%，所有分離株均對(duì)替加環(huán)素敏感。多黏菌素是治療耐藥腸桿菌科細(xì)菌的選擇用藥之一，國內(nèi)專家共識(shí)已明確說明由于腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素也存在耐藥，故臨床不能單一用藥，應(yīng)聯(lián)合用藥[10]。

除了mcr-1基因外，這6株菌株還攜帶其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因，特別是菌株E6還攜帶blaNDM-5基因。多黏菌素是治療產(chǎn)金屬酶菌株的最后用藥之一，然而出現(xiàn)了同時(shí)攜帶金屬酶耐藥基因及多黏菌素耐藥基因mcr-1的大腸埃希菌，提示菌株耐藥基因有進(jìn)一步整合趨勢(shì)，從而加速全耐藥表型菌株出現(xiàn)。已有研究表明，blaNDM基因能夠與替加環(huán)素或多黏菌素耐藥表型共存于同一菌株中[11]，這無疑會(huì)導(dǎo)致所謂的“超級(jí)細(xì)菌”分離株，并加速進(jìn)入“抗生素后時(shí)代”[12]，臨床需予以重視。

早期研究認(rèn)為攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌以散發(fā)克隆為主[9]，本研究進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)。MLST研究顯示6株攜帶多黏菌素耐藥的大腸埃希菌均為不同克隆型別，基因進(jìn)化樹進(jìn)一步明確菌株之間無遺傳關(guān)聯(lián)，但近年來mcr-1基因在腸桿菌科中的廣泛傳播仍需引起臨床關(guān)注[13]。此外，接合實(shí)驗(yàn)表明mcr-1基因都定位于可結(jié)合質(zhì)粒上，可導(dǎo)致該基因進(jìn)一步水平播散。質(zhì)粒介導(dǎo)多黏菌素耐藥基因mcr-1在大腸埃希菌中出現(xiàn)，應(yīng)引起臨床高度重視，加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格控制醫(yī)院感染，避免多黏菌素耐藥大腸埃希菌暴發(fā)流行。