腸溶緩釋型替米考星固體分散體的制備、鑒定及體外釋放度評價(jià)

伍濤，唐達(dá)

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

合理規(guī)避替米考星(tilmicosin，TMC)水溶性差、適口性差、毒副作用大和胃刺激性大等缺點(diǎn)[1]，利用緩控釋技術(shù)有效掩蓋其苦味和降低毒副作用，是該藥劑型發(fā)展的新方向[2].本試驗(yàn)綜合考慮替米考星的物理化學(xué)性質(zhì)以及操作簡單便于工業(yè)化生產(chǎn)等因素，將腸溶性緩釋材料羧甲基乙基纖維素(CMEC)、丙烯酸樹脂(Eudragit L100)和羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP hp55s)作為載體，采用溶劑法制備腸溶緩釋型替米考星固體分散體，對于控制替米考星在胃腸液中的溶出度，提高替米考星的生物利用度具有重要意義，也為替米考星劑型開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論參考，同時(shí)為該類獸藥的科學(xué)合理使用創(chuàng)造更好條件.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

替米考星原料(含量94.01%,批號TMCZ1901011,寧夏泰瑞制藥股份有限公司)；替米考星對照品(含量93.9%,批號k0311407,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；市售替米考星腸溶顆粒(含量20%,批號T1909011,湖北某動物藥業(yè)有限公司)；CMEC(廣州錦驊化工科技有限公司)；Eudragit L100(批號B181103223,德國EVONIK公司)；HPMCP(浙江德清維康生物科技有限公司)；無水乙醇、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、二丁胺、甲醇、乙腈等(色譜純,重慶川東化工有限公司).

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(型號agilent1260,安捷倫)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號OSB-2200,東京理化EYELA公司)；真空干燥箱(型號DZF-6050型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；冰箱(型號BCD-212YM/T,海信容聲冰箱有限公司)；智能溶出試驗(yàn)儀(型號ZRS-8G,上海圣科儀器設(shè)備有限公司)；多功能X射線衍射儀(型號XRD-7000S/L型,日本島津)；傅里葉變換紅外光譜儀(型號IRTracer-100，日本島津)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(型號DF-101S,鄭州長城)；高速萬能粉碎機(jī)(型號DFY-400C，無錫沃信).

1.3 腸溶緩釋型替米考星固體分散體的制備

參考固體分散體的常用制備方法[3]，本研究采用溶劑法制備3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體.

1.3.1 替米考星CMEC固體分散體(TMC+CMEC SD)的制備 精確稱量8 g CMEC到90 mL 90%乙醇-水(v/v)溶液中，50 ℃水浴條件下攪拌至澄明使完全溶解后，緩慢加入2 g替米考星繼續(xù)攪拌45 min，得TMC+CMEC乙醇-水混合溶液.

1.3.2 替米考星Eudragit固體分散體(TMC+Eudragit SD)的制備 精確稱量2 g替米考星和8 g Eudragit L100到80 mL 95%乙醇-水(v/v)溶液中，50 ℃水浴條件下攪拌至澄明使完全溶解后，繼續(xù)攪拌30 min，得TMC+Eudragit乙醇-水混合溶液.

1.3.3 替米考星HPMCP固體分散體(TMC+HPMCP SD)的制備 精確稱量2 g替米考星和8 g HPMCP hp55s到100 mL 80%乙醇-水(v/v)溶液中，50 ℃水浴條件下攪拌至澄明使完全溶解后，繼續(xù)攪拌30 min，得TMC+HPMCP乙醇-水混合溶液.

將上述所得混合溶液分別轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至粘稠狀態(tài)或形成干燥粉末層(水浴溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速40 r/min)，然后迅速倒入預(yù)冷的金屬托盤中，在-20 ℃冰箱中固化24 h，取出置于40 ℃真空干燥箱中干燥18～36 h，徹底除去溶劑.取出粉碎，過80目篩，放置干燥器避光保存.

1.4 替米考星含量的測定方法

1.4.1 溶液的配制 磷酸鹽緩沖液：取0.1 mol/L的鹽酸溶液和0.2 mo1/L磷酸鈉溶液，按3∶1混合均勻，必要時(shí)用2 mol/L的鹽酸或2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8.磷酸溶液：取磷酸5.71 g，加水900 mL用12.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至(2.5±0.1)，加水至1 000 mL.供試品溶液：取適量替米考星腸溶性固體分散體粉末(以替米考星計(jì)約0.2 g)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加提取液磷酸鹽緩沖液10 mL，超聲處理15 min，放冷后加乙腈10 mL，再加磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻后即得.對照品溶液的配制：取替米考星對照品適量，精密稱定，加乙腈制成每毫升中含0.25 mg的溶液，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用上述磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻后即得.

1.4.2 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠(250 mm×4.6 mm,5 μm)為填充劑；以水-磷酸二丁胺緩沖液[取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液(1→10)70 mL，邊加邊攪拌，放冷后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至(2.5±0.1)，加水至100 mL](975∶25)為流動相A，以乙腈為流動相B.檢測波長為280 nm；流速為每分鐘1.1 mL.

1.4.3 線性關(guān)系考察 精確稱取替米考星對照品50 mg，置50 mL容量瓶中，加入乙腈5 mL溶解，加流動相至刻度，搖勻備用.分別量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0及10.0 mL至25 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制備濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.20、0.40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對照品.將上述各濃度的對照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以替米考星溶液的濃度對峰面積作線性回歸，繪制替米考星標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.4 精密度、穩(wěn)定性和回收率試驗(yàn) 精密度試驗(yàn)：精密吸取120 μg/mL對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測量峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值.穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別精密吸120 μg/mL對照品溶液20 μL于0、2、4、8、10、12及24 h進(jìn)樣，測量峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值.回收率試驗(yàn)：取替米考星對照品約0.005、0.010及0.015 g，精密稱定，分別置于50 mL的容量瓶中，加乙腈5 mL溶解，然后加入已知含量的樣品溶液(300 μg/mL)5 mL，加流動相至刻度，搖勻，進(jìn)樣，測定替米考星的含量，除去樣品本底，計(jì)算回收率及RSD值.

1.5 物象鑒定

參照固體分散體表征手段[4]，將替米考星原料藥和制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體分別進(jìn)行X射線粉末衍射(XRPD)和傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)試驗(yàn).

1.5.1 X射線粉末衍射法 檢測依據(jù)為JY/T009-1996轉(zhuǎn)靶多晶體X射線衍射方法通則.測試條件：Cu靶，PIXceIID探測器，Ni濾波片，電壓40 kV，電流40 mA，角度范圍30°～60°，掃描速度12°/min，取適量樣品填充樣品槽，壓實(shí)刮平，使用正裝法進(jìn)樣，分別進(jìn)行X射線衍射分析.

1.5.2 傅里葉變換紅外光譜法 在紅外光燈照射下，將KBr置入瑪瑙研缽中研磨，直到KBr粉末中呈現(xiàn)出均勻的粉末狀.為了確保紅外圖譜的質(zhì)量，將供試品和KBr以1∶50～100的比例混合均勻，再放入研缽中進(jìn)行研磨.取適量粉末放入壓片機(jī)進(jìn)行壓片，在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描.

1.6 體外溶出度的測定

1.6.1 酸中溶出量 分別取替米考星原料、市售替米考星腸溶顆粒和制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體(以替米考星計(jì)約0.5 g)，按照釋放度測定法[5]，用溶出度測定法第二法(漿法)裝置，以0.1 mol/L鹽酸溶液750 mL為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速75 r/min，依法操作，經(jīng)120 min時(shí)，取樣10 mL，濾過待檢.

1.6.2 緩沖液中的累計(jì)溶出度 在上述市售替米考星腸溶顆粒和制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體的酸液中加入溫度為(37±0.5)℃的0.2 mol/L磷酸鈉溶液250 mL(必要時(shí)用2 mol/L鹽酸溶液或2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8)，繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60 min.于2、5、8、10、15、22、30、45、60 min取樣10 mL，濾過待檢.每次取樣后補(bǔ)充相同釋放介質(zhì)10 mL.采用高效液相色譜法分別測定峰面積，計(jì)算出不同時(shí)間樣品液的濃度，求算藥物的累積溶出百分率，計(jì)算累積溶出度，繪制溶出曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測定方法研究結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系考察 線性關(guān)系考察結(jié)果見圖1，線性回歸方程為y=3 604.83x+19 756.99(r2=0.999 5)，替米考星濃度在40～400 μg/mL范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系.

圖1 替米考星標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 精密度、穩(wěn)定性和回收率試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，精密度RSD0.64%，穩(wěn)定性RSD0.61%；平均回收率100.12%，RSD1.58%.說明本方法測定精密度和穩(wěn)定性良好，回收率高，可滿足腸溶緩釋型替米考星固體分散體含量測定要求.

2.2 物象鑒定結(jié)果

2.2.1 X射線粉末衍射分析 檢測結(jié)果用軟件Origin進(jìn)行繪制，見圖2.經(jīng)X射線衍射表征后發(fā)現(xiàn)，替米考星是一種無定型物質(zhì)，沒有特征衍射峰出現(xiàn)，只是在低角度處具有一些疊狀衍射峰，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-7].使用不同腸溶性載體制備的替米考星固體分散體分別在9°、17°和23°左右處具有特征衍射峰.說明替米考星以無定形態(tài)分散在載體中，制備的腸溶緩釋型替米考星固體分散體為晶體結(jié)構(gòu).

圖2 腸溶緩釋型替米考星固體分散體XRPD檢測結(jié)果

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜法分析 如圖3～6所示，替米考星在1 592 cm-1和1 456 cm-1處有中等強(qiáng)度的吸收峰，分別為N-H彎曲振動和C-H的不對稱彎曲振動吸收峰.在2 966 cm-1和2 933 cm-1處具有尖銳的吸收峰，分別為-CH2和-CH3的不對稱伸縮振動峰.在1 168 cm-1和1 082 cm-1處具有強(qiáng)烈吸收峰，分別為C-O和C-O-C的伸縮振動.分析發(fā)現(xiàn)，1 592 cm-1和1 456 cm-1的中等吸收峰相對減弱，2 966 cm-1和2 933 cm-1處的尖銳吸收峰以及在1 168 cm-1和1 082 cm-1處的強(qiáng)烈吸收峰均消失，這說明替米考星原料藥已分散于不同載體中.

圖3 替米考星原料FTIR檢測結(jié)果

2.3 體外溶出度測定結(jié)果

2.3.1 酸中溶出量 替米考星原料、市售替米考星腸溶顆粒和腸溶緩釋型替米考星固體分散體在120 min時(shí)的酸中溶出量見表1.結(jié)果顯示，替米考星原料幾乎全部溶出(97.46%)，市售替米考星腸溶顆粒溶出量為16.07%，而試驗(yàn)制得的3種固體分散體溶出量分別為8.91%、6.57%和7.04%.因此本試驗(yàn)制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體均符合獸藥典對腸溶制劑在酸中溶出量小于10%的規(guī)定.

圖4 TMC+CMEC SD的FTIR檢測結(jié)果

圖5 TMC+Eudragit SD的FTIR檢測結(jié)果

圖6 TMC+HPMCP SD的FTIR檢測結(jié)果

表1 腸溶緩釋型替米考星固體分散體的酸中溶出量

2.3.2 緩沖液中累計(jì)溶出度 市售替米考星腸溶顆粒和腸溶緩釋型替米考星固體分散體在2、5、8、10、15、22、30、45、60 min時(shí)的累計(jì)溶出度見表2和圖7.結(jié)果顯示，市售替米考星腸溶顆粒溶出較慢，60 min時(shí)最終累計(jì)溶出度43.31%，有效成分釋放不完全.而試驗(yàn)制備的3種固體分散體在緩沖液中的釋放效果較理想，45 min時(shí)累計(jì)溶出度均達(dá)70%以上，60 min時(shí)最終累計(jì)溶出度分別為71.67%、77.04%和73.87%，有效成分釋放迅速且完全.因此本試驗(yàn)制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體均符合獸藥典對腸溶制劑在緩沖液中累計(jì)溶出度不低于70%的規(guī)定.

圖7 緩沖液累計(jì)溶出曲線

表2 緩沖液累計(jì)溶出度試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 替米考星口服制劑的胃刺激性問題

替米考星對胸膜肺炎放線菌、巴氏桿菌引起的畜禽呼吸疾病有較理想的治療效果[8-9]，是目前治療該類呼吸道感染用量最大、最常用的藥物之一，該藥的不良反應(yīng)主要是在腸道外給藥時(shí)對心臟腎臟的毒性作用[10]，因此替米考星口服給藥更安全有效.但替米考星味苦，動物拒食情況非常普遍，同時(shí)替米考星口服時(shí)在胃中溶解釋放與胃黏膜接觸，刺激胃黏膜分泌過多胃液，引起胃出血、胃潰瘍[11].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，替米考星在胃中溶解釋放同時(shí)也會大大降低其生物利用度[12]，這顯著增加了用藥成本.目前，一些研究人員將替米考星制作成鹽[13]，或者做成微囊[14]、納米乳[15]、包合物[16]等新型制劑，甚至用水溶性載體制備成水溶性替米考星固體分散體[17-18]，雖能不同程度地掩蓋苦味、提高溶解度和生物利用度，但依然沒有真正解決口服替米考星對胃的刺激性問題.

3.2 載體材料的選擇

固體分散體技術(shù)(solid dispersion,SD)是指通過一定方法使藥物以分子、微晶或無定形態(tài)高度分散在適宜載體材料中的固態(tài)分散技術(shù)[19].不同載體制備的固體分散體，可表現(xiàn)出不同的溶出特性，親水性載體可增加難溶性藥物的溶出速度和溶解度，并提高藥物的生物利用度；難溶性載體可延緩或控制藥物釋放，使藥物長效化；而腸溶性載體可控制藥物于小腸中靶向釋放[20].隨著藥劑學(xué)的發(fā)展及新輔料的不斷出現(xiàn)，結(jié)合動物生理生化特征和用藥特點(diǎn)，選擇CMEC、Eudragit L100和HPMCP hp55s 3種腸溶性緩釋材料[21-23]作為載體制備腸溶緩釋型替米考星固體分散體，既可掩蓋替米考星苦味，又可靶向在動物腸道前端位置定位釋放，有效解決替米考星的胃刺激性問題，同時(shí)制得的成品呈粉末狀，可拌料給藥，便于群防群控.

3.3 制備方法的選擇

由于替米考星熔點(diǎn)較高，因此本試驗(yàn)采用溶劑法制備替米考星固體分散體，相對于流化床包衣法、溶劑-噴霧(冷凍)干燥法等制備固體分散體的新工藝[24-25]，本法具有收率高、步驟簡易和成本較低的特點(diǎn)，同時(shí)通過安裝溶劑自動回收裝置，可以有效對溶劑進(jìn)行回收和循環(huán)再利用，進(jìn)一步節(jié)約成本，避免環(huán)境污染.

3.4 體外溶出度測定的選擇

體外溶出度測定是篩選緩控釋制劑處方和質(zhì)量控制的重要手段[26]，目前以轉(zhuǎn)籃法和槳法應(yīng)用最廣泛，且均符合2015年版《獸藥典》附錄0931的相關(guān)規(guī)定.槳法攪拌速度雖然與轉(zhuǎn)籃法籃子的轉(zhuǎn)動速度一致，但槳法中攪拌槳的擺動強(qiáng)度大，攪拌范圍寬，強(qiáng)有力的攪拌更有利于樣品的溶出釋放，因此本研究采用槳法對替米考星原料、市售替米考星腸溶顆粒和腸溶緩釋型替米考星固體分散體進(jìn)行了體外溶出度的測定.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)制得的TMC+CMEC SD、TMC+Eudragit SD和TMC+HPMCP SD 3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體，通過XRPD和FTIR物象鑒別試驗(yàn)，驗(yàn)證了替米考星以無定形態(tài)分散于3種不同腸溶性緩釋載體材料中.3種固體分散體的體外溶出度結(jié)果較為理想，均符合獸藥典中對腸溶制劑在酸中溶出量小于10%、在緩沖液中累計(jì)溶出度不低于70%的規(guī)定，為替米考星口服新劑型的開發(fā)應(yīng)用提供了理論參考.3種腸溶液緩釋型替米考星固體分散體操作簡單，具有良好的開發(fā)前景.