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      貴定云霧茶本地種和引進(jìn)種次生代謝產(chǎn)物差異分析

      2021-07-17 05:19:16王春波韋玲冬郭治友
      食品工業(yè)科技 2021年14期
      關(guān)鍵詞:云霧茶黃酮醇糖苷

      王春波,呂 輝,韋玲冬,郭治友

      (黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院,貴州都勻 558000)

      茶(Camellia sinensis(L.)O.Ktze)是世界上僅次于水的第二受歡迎的飲料,茶樹作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,已在50 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)被廣泛種植[1]。茶的質(zhì)量主要通過香氣、風(fēng)味和外觀等感官特性來評(píng)估,受多種因素的影響,包括遺傳背景、生長(zhǎng)環(huán)境、收獲季節(jié)、葉片分選、加工和貯藏等[2]。此外,茶中含有大量可溶性物質(zhì),例如兒茶素、咖啡因、茶氨酸、多酚、有機(jī)酸和維生素等,這些物質(zhì)含量的多少直接影響茶葉的質(zhì)量[3]。根據(jù)加工方式的不同,茶葉可分為綠茶、白茶、紅茶、黑茶、黃茶和烏龍茶等不同類型[4]。已有報(bào)道表明,不同類型茶葉之間代謝物含量差異較大[5]?;诖?,研究不同茶樹品種葉片中代謝物含量的差異就顯得尤為重要。

      代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一種研究方法,它能夠?qū)ι飿颖局兴械头肿恿看x產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析,并鑒定出具有重要生物學(xué)意義的組間顯著差異代謝物,闡明這些差異物的生理過程和代謝機(jī)制[6]。目前,代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛運(yùn)用到茶產(chǎn)業(yè)的各個(gè)環(huán)節(jié),更加全面地了解茶葉從栽培到加工過程中內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律,揭示茶葉風(fēng)味形成的原因,從而提高茶葉品質(zhì)和健全茶葉安全性保障[7?9]。

      貴定云霧茶是世界名茶,已多次獲得國(guó)際大獎(jiǎng)[10]。云霧野生茶樹主要分布在貴定縣南面云霧鎮(zhèn)的云霧山中,海拔高度1300 多米。茶樹葉色鮮綠,葉芽壯實(shí)肥大,形狀秀麗,茸毛較多,內(nèi)部含有物質(zhì)豐富,是優(yōu)良的育種原料[11]。近些年來,隨著市場(chǎng)需求的變化,云霧茶也引進(jìn)了小葉種,這就導(dǎo)致云霧茶在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)加工混亂、品質(zhì)差參不齊等現(xiàn)象。鑒于此,本文利用代謝組學(xué)研究貴定云霧茶本地種和引進(jìn)種之間的代謝差異,結(jié)果可為云霧茶的加工工藝改良、滋味品質(zhì)提升和功能性成分富集等方面提供依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 材料與儀器

      貴定云霧茶本地種(中葉種,寬橢圓形葉片,小喬木)、云霧茶引進(jìn)種(小葉種,窄橢圓形葉片,灌木)茶樹樣品于2020年4月采自貴定縣云霧鎮(zhèn)茶場(chǎng)(26°34'48" N,107°13'52" E),每個(gè)品種隨機(jī)挑選9 株茶樹并采集新鮮葉片樣品,共18 個(gè)樣品;乙腈、氨水、甲醇、醋酸銨 色譜純,德國(guó)Merck 公司。

      BSA124S-CW 型天平 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;D24 UV 純水儀 德國(guó)Merck Millipore公司;JXFSTPRP-24 型研磨儀 上海凈信科技有限公司;Agilent 1290 超高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;TripleTOF 4600 型四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX 公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 樣品制備 將茶樹葉片置于研缽中加入液氮搗碎,接著用料理機(jī)打成粗粉,然后放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h,最后用組織研磨機(jī)研磨成細(xì)粉。每個(gè)茶樹稱取研磨后的粉末狀葉片樣品50 mg左右,加入500 μL 甲醇(含5 μg/mL L-2-氯-苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)),勻漿破碎2 min。超聲功率為250 W,60 ℃下提取15 min。4 ℃,13000 r/min 離心15 min,取200 μL 上清進(jìn)樣。每個(gè)茶樹品種設(shè)置9 個(gè)平行樣品。此外,取等量的18 份待測(cè)樣品進(jìn)行混合,作為質(zhì)控樣品。

      1.2.2 色譜條件 色譜柱為XSelect ? HSS T3(2.5 μm,100 mm×2.1 mm)。流動(dòng)相A:水溶液(0.1%甲酸),流動(dòng)相B:乙腈溶液(0.1%甲酸)。流速:0.35 mL/min,柱溫:25 ℃,進(jìn)樣量:2.0 μL。優(yōu)化的色譜梯度為:0~2 min,5%B;2~10 min,5%~95%B;10~15 min,95%B;15~18 min,95%~5%B。

      1.2.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜以正、負(fù)離子兩種模式運(yùn)行。優(yōu)化的參數(shù)如下:毛細(xì)管電壓:正離子模式為4 kV,負(fù)離子模式為3.5 kV;掃描范圍70~1000 m/z;掃描速率7 Hz;毛細(xì)管溫度320 ℃;鞘氣流速45 PSI;輔助氣流速15 PSI。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      本研究利用XCMS 軟件和METLIN 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代謝物進(jìn)行定性分析,首先將原始數(shù)據(jù)通過安捷倫Masshunter Qualitative Analysis 分析軟件轉(zhuǎn)換為通用格式(mz.data)。然后基于R 語(yǔ)言XCMS 程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化處理,得到一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣。接著將矩陣導(dǎo)入到SIMCA-P 軟件用于代謝物的定量分析和后續(xù)的主成分分析(principal component analysis,PCA)以及正交偏最小二乘判別分析(orthogonal least squares discriminant analysis,OPLS-DA),以檢測(cè)代謝差異物[12]。應(yīng)用MetaboAnalyst 軟件和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路分析[13]。最后根據(jù)差異代謝物含量的不同利用MeV 4.9 軟件進(jìn)行熱圖分析[14]。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 UPLC-QTOF-MS 鑒定結(jié)果

      本研究基于UPLC-QTOF-MS 技術(shù)分析了貴定云霧茶本地種和引進(jìn)種的代謝差異,結(jié)果同時(shí)與一級(jí)m/z 和碎片離子(二級(jí))m/z 數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到的代謝物正離子模式下為147 個(gè)(本地種147 個(gè),引進(jìn)種144 個(gè)),負(fù)離子模式下為361 個(gè)(本地種和引進(jìn)種各361 個(gè))。鑒于在負(fù)離子模式下可以檢測(cè)到更多的峰,并且在后續(xù)的多元統(tǒng)計(jì)分析中負(fù)離子模式下的模型參數(shù)更可靠和更具有預(yù)測(cè)性,所以本文的后續(xù)數(shù)據(jù)分析都采用負(fù)離子模式下采集到的數(shù)據(jù)。圖1即為本地種和引進(jìn)種樣品在質(zhì)譜ESI-條件模式下掃描的基峰圖。從圖1中可以看出本地種樣品在0.3~0.96 min、2.45~4.08 min 和7.94~10.95 min 時(shí)物質(zhì)相對(duì)豐度較高,而引進(jìn)種樣品在0.3~0.91 min、2.53~4.34 min 和7.95~10.93 min 時(shí)物質(zhì)相對(duì)豐度較高,這表明不同品種茶樹樣品在負(fù)離子模式下的出峰數(shù)量和相對(duì)豐度存在一定的差異。

      圖1 樣品負(fù)離子模式下基峰圖Fig.1 Base peak map of samples in negative mode

      2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

      將負(fù)離子模式下收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 和OPLS-DA 分析,結(jié)果表明本地種和引進(jìn)種樣品呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì)(圖2)。在PCA 得分圖中,主成分1 和2 的貢獻(xiàn)值分別為61.4%和23.8%,樣品累計(jì)貢獻(xiàn)值超過85%,說明代表性較好。另外,主成分分析也可以反映物質(zhì)豐度的分布情況,越相似的樣品距離越近,反之則越遠(yuǎn)。主成分分析中,本地種樣品主要分布在主成分1 的負(fù)軸位置,而引進(jìn)種樣品主要分布在主成分1 的正軸位置,并且不同品種間的樣本距離較遠(yuǎn),這表明云霧茶本地種和引進(jìn)種代謝物差異較大。OPLS-DA 得分圖中,各品種的樣本劃分明確,沒有分散,模型驗(yàn)證后參數(shù)值R2X 為88.5%,R2Y 為92.4%,Q2為87.1%,值均接近1,說明負(fù)離子模型下具有較好的預(yù)測(cè)性和可靠性。

      圖2 主成分分析和正交偏最小二乘判別分析Fig.2 Principal component analysis and orthogonal least squares discriminant analysis

      2.3 差異代謝物和代謝通路分析

      OPLS-DA 載荷圖可以直觀地顯示不同品種樣本間的差異代謝物,其中的各點(diǎn)代表不同的代謝物,距離坐標(biāo)原點(diǎn)越遠(yuǎn)越分散的為顯著差異代謝物。本研究對(duì)鑒定到的361 個(gè)代謝物進(jìn)行差異性篩選,標(biāo)準(zhǔn)為VIP≥1、P<0.05 和FC≥2 或FC≤?2。其中FC(fold change)代表樣本間代謝物的差異倍數(shù),即代謝物在本地種和引進(jìn)種中含量的比值。結(jié)果共篩選到14 個(gè)顯著差異代謝物,OPLS-DA 載荷圖見圖3,其中包括4 種黃酮醇類物質(zhì)(1~4 號(hào))、4 種酚酸類物質(zhì)(5~8 號(hào))、3 種黃酮糖苷類物質(zhì)(9~11 號(hào))、2 種兒茶素(12~13 號(hào))和1 種原花青素B1(14 號(hào))(表1),均為茶樹常見的次生代謝產(chǎn)物,其中兒茶素是茶湯苦味的主要來源,黃酮醇和黃酮糖苷類物質(zhì)對(duì)于澀味貢獻(xiàn)較大,這些物質(zhì)含量的多少直接決定茶葉的品質(zhì)。

      表1 不同云霧茶樹品種的差異代謝物Table 1 Differencial metabolites between two varieties

      圖3 正交偏最小二乘判別分析載荷圖Fig.3 Loading plot of orthogonal least squares discriminant analysis

      根據(jù)14 種差異代謝物的相對(duì)豐度進(jìn)行了熱圖分析(圖4)。結(jié)果顯示兒茶素和原花青素B1 在云霧茶本地種中含量較高,而黃酮醇和黃酮糖苷類物質(zhì)在引進(jìn)種中含量較高。

      圖4 差異代謝物熱圖Fig.4 Heat map of differential metabolites between two varieties

      另外,利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)14 個(gè)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析(圖5,圖6)。結(jié)果顯示這些差異代謝物主要集中分布于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑(phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)、類黃酮代謝途徑(flavnoid biosynthesis)以及黃酮和黃酮醇代謝途徑中(flavone and flavonol biosynthesis)。它們屬于茶葉代謝的主要途徑,直接影響著決定茶葉品質(zhì)關(guān)鍵物質(zhì)的積累。首先,4 種酚酸類差異代謝物集中在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑中(圖5),這些物質(zhì)含量的變化關(guān)系到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的積累,間接影響茶葉的鮮味。其余10 種差異代謝物分布于類黃酮代謝途徑以及黃酮和黃酮醇代謝途徑中(圖6),這兩個(gè)途徑是類黃酮化合物合成的關(guān)鍵途徑。類黃酮化合物主要包括黃酮醇、黃酮、兒茶素(黃烷-3-醇)、花青素和原花青素等,在茶樹中其含量約占鮮葉干重的30%,遠(yuǎn)高于其它物種[15]。在茶葉加工過程中,這些化合物含量的差異是制作不同茶類的依據(jù)。如Gai 等[16]利用代謝組學(xué)技術(shù)研究不同茶樹品種代謝差異時(shí)發(fā)現(xiàn)QN3 品種類黃酮生物合成途徑比較活躍,特別是兒茶素組分的含量明顯高于其它品種,基于此認(rèn)為QN3 品種是綠茶加工的良好原料。Li 等[17]分析了適合綠茶和黑茶加工的不同茶樹品種的代謝特點(diǎn),其中氨基酸和類黃酮類物質(zhì)差異較大,研究結(jié)果為不同茶樹品種的加工提供參考依據(jù)。此外,Zeng 等[18]研究不同時(shí)期白茶葉片代謝組學(xué)時(shí)檢測(cè)到很多差異代謝物都分布在黃酮和黃酮醇代謝途徑中,尤其在葉片復(fù)綠期間黃酮醇和黃酮糖苷類物質(zhì)含量增加顯著。同樣,已有報(bào)道表明較高含量的黃酮醇和黃酮糖苷類物質(zhì)是白茶區(qū)別與其它類型茶葉的標(biāo)志[15]。

      圖5 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑Fig.5 Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis

      圖6 黃酮和黃酮醇代謝途徑以及類黃酮代謝途徑Fig.6 Flavone and flavonol biosynthesis,and flavnoid biosynthesis

      云霧茶本地種生長(zhǎng)在貴定云霧山中,這里海拔高,晝夜溫差大,雨量充沛,云霧多,濕度較大。這些生態(tài)條件有利于含氮化合物和芳香類物質(zhì)的積累,而澀味較重的黃酮醇和黃酮糖苷類物質(zhì)含量則較低[19]。另外,茶葉中兒茶素、原花青素B1、黃酮醇和黃酮糖苷類物質(zhì)在代謝途徑中存在共同前體(圖6),黃酮醇和黃酮糖苷組分合成的減少會(huì)相對(duì)的增加兒茶素和原花青素B1 的積累。這些物質(zhì)含量的差異對(duì)于茶葉加工至關(guān)重要。已有研究表明白茶與綠茶之間代謝物含量分布存在較大差異,兒茶素組分含量白茶低于綠茶,而黃酮醇和黃酮糖苷類則相反[20]。這是因?yàn)榫G茶加工過程中高溫殺青作用使多酚氧化酶等酶類活性鈍化后兒茶素得以保留[21?22],同時(shí)高溫作用也會(huì)引起黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)分解而導(dǎo)致含量降低[23?24];而白茶全程萎凋的工藝特點(diǎn)使得葉片物理結(jié)構(gòu)保持完整,酶活性未受破壞導(dǎo)致兒茶素組分較大程度降低,非酯型兒茶素尤為明顯,但是沒有高溫作用黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)在白茶中得以保留[15,25]。花青素組分與兒茶素組分規(guī)律類似,大部分花青素組分在白茶中明顯低于綠茶,因?yàn)榛ㄇ嗨匚蜻^程中含量會(huì)降低[26]。在本研究中,原花青素B1 和2 種非酯型兒茶素在云霧茶本地種中要高于引進(jìn)種,而3 種黃酮醇和4 種黃酮糖苷物質(zhì)在引進(jìn)種中要高于本地種。鑒于此得出,云霧茶本地種更適合綠茶的加工,而引進(jìn)種更適合白茶的加工。

      3 結(jié)論

      本文利用UPLC-QTOF-MS 技術(shù)并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法分析了貴定云霧茶本地種和引進(jìn)種之間的代謝差異,結(jié)果由于正離子模型參數(shù)不可靠且沒有預(yù)測(cè)性,只在負(fù)離子模型下鑒定出14 個(gè)顯著差異代謝物。這些差異代謝物主要分布于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑、類黃酮代謝途徑以及黃酮和黃酮醇代謝途徑中。另外,不同茶樹品種中差異代謝物含量變化分析表明云霧茶本地種更適合綠茶的加工,而引進(jìn)種更適合白茶的加工,但這些差異代謝物含量變化的具體生理過程和機(jī)制還有待后續(xù)深入的研究。綜上所述,本研究結(jié)果可為云霧茶的加工方法和良種選育提供理論依據(jù)。

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