骨橋蛋白與生殖系統(tǒng)疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展

韋玉霞，廖碧云，陸玉蘭，胡林林，張婷，莫海藝，陳興鴻，楊鳳蓮

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 百色 533000)

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種普遍存在于哺乳動(dòng)物的多功能糖基化酸性蛋白，在1979年首次被發(fā)現(xiàn)，富含天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸，因其介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)的連接，故被稱為骨橋蛋白[1]，也被稱為早期T淋巴細(xì)胞活化1和骨涎蛋白1[2]，是一種分泌磷蛋白，屬于小整合素結(jié)合配體連接蛋白(SIBLING)家族的一部分。OPN最初被認(rèn)為是一種骨基質(zhì)蛋白質(zhì)，隨后被發(fā)現(xiàn)它還是一種細(xì)胞因子，參與了致癌、組織形成和免疫反應(yīng)。OPN由破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞及活化的T細(xì)胞等分泌，廣泛分布于體內(nèi)各種組織和細(xì)胞中，也存在于血液、母乳等各種體液中[3]。OPN具有多種生物學(xué)功能，研究發(fā)現(xiàn)其參與骨基質(zhì)的礦化和吸收、組織創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞黏附與趨化等許多生理過(guò)程，在泌尿、心血管、免疫、消化等多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。近年OPN在腫瘤方面的研究得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，已有證據(jù)證明其參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程[6-7]。 有研究發(fā)現(xiàn)其在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中廣泛存在并在生殖過(guò)程發(fā)揮重要的作用[8]。隨著生物信息學(xué)及基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使人們從基因水平找出疾病發(fā)生的易感基因成為可能。為此，本文對(duì)OPN及其基因在生殖過(guò)程的作用進(jìn)行綜述。

1 OPN的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能與分布

OPN在哺乳動(dòng)物中普遍存在，經(jīng)過(guò)翻譯修飾后的OPN蛋白，在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成的分子大小也有不同，分子量為44～75 kd，呈中度同源。從NCBI和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm. nih.go-v/gene/6696和http://www.uniprot.org/uniprot/P10451)查詢得知，OPN具有5種不同的轉(zhuǎn)錄變體，它們編碼了OPN基因的5種亞型，分別是OPN-a、OPN-b、OPN-c、OPN-d、OPN-e，以前3種較多見(jiàn)。在生成穩(wěn)定的OPN蛋白前，編碼OPN的基因在蛋白質(zhì)的加工修飾階段如轉(zhuǎn)錄、翻譯等均經(jīng)歷了很大的變化，尤其是絲氨酸和蘇氨酸殘基都進(jìn)行了糖基化和磷基化，這在介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)的連接過(guò)程中發(fā)揮重要作用。OPN由多個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域組成，包括N端的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶結(jié)合殘基(OPN-OPN間接交聯(lián)聚合物)、絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)磷酸化位點(diǎn)、凝血酶裂解位點(diǎn)(RSK)、金屬蛋白酶切割位點(diǎn)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結(jié)構(gòu)域(GRDGD)、鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域、七肽序列(SVVYGLR )結(jié)構(gòu)域和C端的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[9-10]。其中，鈣結(jié)合區(qū)域在鈣離子介導(dǎo)或參與的反應(yīng)過(guò)程中起重要作用，使得RGD序列與整合蛋白結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞間的黏附，細(xì)胞遷移和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，此外，OPN可通過(guò)RGD位點(diǎn)作為配體結(jié)構(gòu)結(jié)合幾種不同的整合素，包括 αVβ1、αVβ3、αVβ5、α4β1、α9β1，其中αVβ3 是其主要受體。OPN的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路是通過(guò)其與αVβ3-整合素或CD44結(jié)合后相互作用而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)OPN被凝血酶片段切割時(shí)，暴露了隱藏在OPN分子內(nèi)部的整合素連接位點(diǎn)162SLAYGLR168，整合素α4β1和α9β1便與后者結(jié)合，結(jié)合后所形成的結(jié)構(gòu)在細(xì)胞黏附中起著重要作用[11]。有研究指出， OPN分子的氨基端區(qū)域與外分泌有關(guān)，N-末端富含天冬氨酸序列、鈣結(jié)合位點(diǎn)，N端的功能區(qū)還與腫瘤播散有關(guān)；羧基端結(jié)合肝素結(jié)構(gòu)域，C-末端參與黏附功能的調(diào)節(jié)，還與免疫逃逸有關(guān)[12]。

OPN主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、血管與骨骼肌細(xì)胞等合成，也可由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞合成和分泌，其廣泛分布于機(jī)體各種組織和細(xì)胞中。OPN的分子結(jié)構(gòu)決定了其具有多種生物學(xué)功能，與不同的受體結(jié)合便產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。它是骨重塑的一個(gè)重要因素，將破骨細(xì)胞錨定在骨的礦物基質(zhì)，在生物礦化中發(fā)揮重要的作用；促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[13]；RGD序列與整合素或CD44v 6/7結(jié)合形成表面糖蛋白參與細(xì)胞間相互作用；OPN還可以激活細(xì)胞內(nèi)通路，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)內(nèi)的基因表達(dá)[14]?？傊?，OPN參與體內(nèi)平衡和病理過(guò)程，包括慢性炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

2 OPN基因及其表達(dá)

3 OPN與生殖

在生殖系統(tǒng)中，OPN在輸卵管、子宮、胎盤(pán)、睪丸、附睪、精子和附屬性腺液等生殖系統(tǒng)均有表達(dá)，其生物學(xué)功能涉及妊娠識(shí)別、胚胎植入、滋養(yǎng)細(xì)胞入侵和胚胎發(fā)育等。因此，研究 OPN 蛋白表達(dá)水平及其基因在生殖領(lǐng)域的關(guān)系，可以幫助我們更深層地了解受精過(guò)程，找出關(guān)鍵基因成為治療生殖疾病的新靶點(diǎn)，或應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)(ART)，以提高妊娠成功率或受精率。

3.1 OPN及其SNP與男性生殖 OPN表達(dá)水平及其基因在輸精管道(附睪、輸精管、射精管、尿道)、睪丸和附屬腺體(精囊腺、前列腺、尿道球腺)中的研究已成為雄性哺乳動(dòng)物生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。早在1992年，Brown LF等[22]發(fā)現(xiàn)了OPN表達(dá)于男性前列腺及睪丸縱隔的上皮細(xì)胞中。隨后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后對(duì)雄性牛、羊、狗、豬、鼠等進(jìn)行了研究，Erikson DW等[23]發(fā)現(xiàn)OPN在荷斯坦牛精子、附睪液和睪丸勻漿中均有表達(dá)，我國(guó)學(xué)者劉倩等[24]進(jìn)一步證實(shí)OPN在小鼠睪丸、附睪組織和精子中呈現(xiàn)特征性表達(dá)，用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞、精子細(xì)胞中OPN表達(dá)濃度高于支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)、Leydig細(xì)胞以及各級(jí)生精細(xì)胞，因而推斷出OPN可能參與精子的發(fā)生及成熟過(guò)程，進(jìn)一步提出OPN可能與精子的活力和受精能力密切相關(guān)。

Moura A等[25]的研究顯示，OPN在雄性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中表達(dá)濃度的高低跟其生育能力存在一定的相關(guān)性，他們發(fā)現(xiàn)高生育率的荷斯坦公牛在其附屬性腺體液中OPN的濃度水平高于低生育公牛，從而認(rèn)為OPN是與生育有關(guān)的精漿蛋白之一。在體外試驗(yàn)中加入一定濃度的OPN蛋白液可以使精子在獲能、精卵結(jié)合以及受精卵的早期卵裂具有促進(jìn)作用。如Boccia L等[26]通過(guò)體外試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在水牛精子與卵母細(xì)胞結(jié)合的培養(yǎng)基中加入適量濃度的OPN液，孵育4 h后觀察發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生頂體反應(yīng)的百分率較沒(méi)有OPN液的對(duì)照組增加，該試驗(yàn)證明OPN具有誘導(dǎo)精子獲能的能力，特別是有肝素同時(shí)存在的情況下，顯示出明顯的協(xié)同作用，進(jìn)一步推斷了OPN在肝素誘導(dǎo)精子獲能進(jìn)程中起著介導(dǎo)作用。此外，還有研究指出，OPN介導(dǎo)的精子獲能以及頂體反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)鈣代謝水平有關(guān)[27]，可能是射精時(shí)精子膜上的OPN通過(guò)肝素結(jié)合域結(jié)合肝素，這種OPN-肝素復(fù)合物能引起細(xì)胞內(nèi)鈣含量的升高，進(jìn)而使精子獲能。

Rodríguez CM等[28]利用Northern blot技術(shù)和原位雜交技術(shù)從基因水平證實(shí)了OPN在單倍體男性配子中的存在。OPN 基因內(nèi)的SNP有的會(huì)對(duì)精漿中OPN蛋白的表達(dá)產(chǎn)生積極或消極的影響，從而影響繁殖能力。Rorie RW等[21]研究OPN基因啟動(dòng)子SNP與牛精液質(zhì)量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在牛OPN基因啟動(dòng)子區(qū)有7個(gè)SNPS能影響精子質(zhì)量，特別與精子運(yùn)動(dòng)質(zhì)量有關(guān)，其中在bp3379位點(diǎn)上的SNP，是由鳥(niǎo)嘌呤代替胸腺嘧啶，這一突變能改善精子運(yùn)動(dòng)促進(jìn)精子快速游動(dòng)。

在關(guān)于男性精子單核苷酸多態(tài)性的研究中，Markandona O等[29]認(rèn)為MLH3基因的SNP rs175080位點(diǎn)與白種人少精子癥有關(guān)。Anifandis G等[30]選擇男性攜帶MLH3基因單核苷酸多態(tài)性(SNP) rs175080并接受胞漿內(nèi)精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)治療的夫婦從胚胎學(xué)角度進(jìn)行研究，首次提出該基因SNP位點(diǎn) rs175080的突變因精子性狀的改變對(duì)體外受精及胚胎發(fā)育沒(méi)有影響。當(dāng)然，上述論斷還需開(kāi)展更多的研究去印證，但這些研究策略為我們研究OPN基因單核苷酸多態(tài)性是否在生殖領(lǐng)域產(chǎn)生影響提供新的研究思路。

3.2 OPN及其基因在子宮及輸卵管中的表達(dá) 除了OPN在雄性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中的表達(dá)研究之外，OPN在雌性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中也有特征性表達(dá)。von Wolff M等[31]通過(guò)免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)，在女性子宮內(nèi)膜的周期性變化中，OPN mRNA在子宮內(nèi)膜分泌期中的表達(dá)量明顯高于增生期，且分泌中期和晚期OPN含量比分泌早期和增生期高約5～10倍，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OPN mRNA僅在內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)，而基質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)有表達(dá)。von Wolff M等[31]和Tulac S等[32]分別應(yīng)用原位雜交法和酶聯(lián)免疫法對(duì)子宮內(nèi)膜中的OPN表達(dá)水平進(jìn)行研究，其研究結(jié)果與上述結(jié)果相似。以上研究表明，OPN高表達(dá)于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌期的中、晚期。

除了在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，OPN還在輸卵管液中也被發(fā)現(xiàn)。Gabler C等[33]在牛輸卵管液中發(fā)現(xiàn)三種OPN分子亞型，分別是OPN-a、OPN-b和OPN-c，其中OPN-a亞型在整個(gè)周期各期間輸卵管液中表達(dá)量最多。還有研究人員通過(guò)RT-PCR和免疫組織化學(xué)法從小鼠輸卵管液中檢測(cè)OPN mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OPN mRNA表達(dá)水平的高低規(guī)律性與小鼠排卵周期呈現(xiàn)同步規(guī)律性，即排卵期OPN mRNA濃度達(dá)到最高值，黃體期OPN mRNA濃度迅速減少，這種現(xiàn)象與雌激素水平的變化一致，推測(cè)輸卵管中OPN mRNA的表達(dá)可能受雌激素的調(diào)控[34]。王佳佳等[35]研究結(jié)果也與上述結(jié)論一致，提出OPN蛋白表達(dá)受到雌激素的調(diào)控，而且兩者呈正相關(guān)。雌激素能夠調(diào)控OPN表達(dá)水平，其作用機(jī)制可能是通過(guò)雌激素PI3K/Akt磷酸化信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，激活雌激素PI3K/Akt磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后使低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α)升高，OPN是HIF-1α在PI3K/Akt信號(hào)通路的下游靶基因，受HIF-1α調(diào)控。因此，OPN的異常表達(dá)也會(huì)影響卵巢卵泡細(xì)胞對(duì)雌激素的分泌。

3.3 OPN在生殖過(guò)程中對(duì)胚胎形成的作用 妊娠過(guò)程大致可以分為受精卵受精、胚胎著床、胎盤(pán)形成與胚胎發(fā)育這幾個(gè)階段，它是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程。在妊娠與非妊娠的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，OPN的表達(dá)亦有區(qū)別。冉靜等[36]用小鼠研究發(fā)現(xiàn)，在孕期小鼠子宮內(nèi)，其內(nèi)膜上皮細(xì)胞的OPN mRNA表達(dá)具有較強(qiáng)的時(shí)段性，小鼠妊娠第4.5天OPN mRNA表達(dá)水平最高，其次是第3.5天和第5.5天表達(dá)稍弱，第6.5天表達(dá)最弱但仍高于非妊娠小鼠，提示OPN參與妊娠與胚胎著床過(guò)程。

OPN在胚胎著床中還發(fā)揮著另一個(gè)重要的作用，就是對(duì)子宮內(nèi)膜容受性建立過(guò)程中的重要參與。Carson DD等[37]通過(guò)基因水平研究，發(fā)現(xiàn)在胚胎植入子宮過(guò)程當(dāng)中，當(dāng)受精卵和子宮內(nèi)膜發(fā)生相互作用時(shí)OPN mRNA在其中發(fā)揮黏附和介導(dǎo)作用，促進(jìn)胚胎著床。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性蛋白整合素αVβ3能夠特異地表達(dá)于胚胎著床期的內(nèi)膜種植窗，而整合素αVβ3又是OPN蛋白的重要受體，其機(jī)制是OPN通過(guò)特征性RGD序列識(shí)別整合素αVβ3受體并與之結(jié)合，兩者在胚胎和子宮內(nèi)膜之間起著介導(dǎo)和黏附作用。因整合素αVβ3正是OPN 蛋白的受體之一，提示OPN也參與子宮內(nèi)膜容受性的建立。胚胎植入過(guò)程和滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲被認(rèn)為是影響妊娠成功的主要因素。滋養(yǎng)細(xì)胞黏附于子宮內(nèi)膜后增殖分化為幾種類型的滋養(yǎng)細(xì)胞，包括絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞(VTs)和外滲滋養(yǎng)細(xì)胞(EVTs)。有研究[38]表明，OPN參與了妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲，OPN在絨毛狀滋養(yǎng)細(xì)胞外壁滋養(yǎng)細(xì)胞中有較強(qiáng)的表達(dá)，滋養(yǎng)細(xì)胞可侵入母體子宮內(nèi)膜和子宮螺旋動(dòng)脈，促進(jìn)胎盤(pán)的形成和組織的重塑。OPN還與胚胎滋養(yǎng)層浸潤(rùn)的深度有關(guān)，表明OPN在胚胎著床過(guò)程中伴隨著胎盤(pán)的形成也起著作用。OPN在胚胎植入過(guò)程中能夠限制胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度侵蝕、下調(diào)母體抗胎兒的免疫應(yīng)答，這有利于胚胎的成長(zhǎng)。可以看出，OPN是影響子宮胚胎微環(huán)境的重要部分，它參與胎盤(pán)的形成并促進(jìn)胚胎發(fā)育和成熟。

陳善萍等[39]分析OPN基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4754的各等位基因和基因型在廣西壯族人群中的分布頻率，以及對(duì)比其在不同種族中的分布差異，研究結(jié)果顯示，骨橋蛋白基因SNP位點(diǎn)rs4754等位基因和基因型在廣西壯族人群中的分布頻率與其他地區(qū)人群相比存在差異。韋貴將等[40]認(rèn)為骨橋蛋白基因rs11728697位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲人群、日本人群和非洲人群存在差異。上述研究提示不同種族間OPN相關(guān)疾病臨床表現(xiàn)及發(fā)病率的差異可能是該基因單核苷酸多態(tài)性的差異導(dǎo)致，但OPN基因單核苷酸多態(tài)性在生殖領(lǐng)域的研究未見(jiàn)有報(bào)道。

4 小結(jié)與展望

綜合上述研究，OPN不管是在男性生殖還是女性生殖系統(tǒng)表達(dá)調(diào)控及其胚胎形成和妊娠的發(fā)生和發(fā)展中都扮演著重要的角色。在男性精子運(yùn)動(dòng)或精卵結(jié)合過(guò)程中精子的獲能、胚胎的發(fā)生及其定位于子宮著床、子宮-胚胎微環(huán)境的改變、胎盤(pán)的形成等過(guò)程均發(fā)揮舉足輕重的作用。關(guān)于OPN在男性和女性生殖系統(tǒng)中的作用及其在生殖領(lǐng)域中的研究已經(jīng)比較成熟，但其研究更多地體現(xiàn)于蛋白層面，而生殖系統(tǒng)OPN基因單核苷酸多態(tài)性的表觀遺傳學(xué)研究仍是較為少見(jiàn)。另一方面，OPN參與的雌激素合成過(guò)程，還涉及其它生殖相關(guān)基因的表達(dá)和PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)等；從縱向方面看，OPN基因可以聯(lián)合其它更多的生殖相關(guān)基因研究，基因-基因和基因-環(huán)境的交互作用在生殖領(lǐng)域的作用還有待投入研究，但還相對(duì)表淺，多基因聯(lián)合不同通路在生殖相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制仍需更多的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)進(jìn)一步豐富。