2型糖尿病患者m6A腺苷的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)及其發(fā)生機(jī)制

陳夜茜

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2. 河南省兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)在60歲以上老人中有很高發(fā)病率，并且在我國(guó)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。但是，其病理機(jī)制尚未得到準(zhǔn)確結(jié)論。已有研究表明，T2DM的發(fā)病與很多基因以及環(huán)境相關(guān)因素有很大聯(lián)系[1]。有研究指出，脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase catalytic ，G6PC)等基因失調(diào)可能會(huì)產(chǎn)生糖脂代謝異常。這些基因在T2DM的病理過程中有重要作用[2-5]，但這些基因的異常表達(dá)是由于哪些體內(nèi)或體外環(huán)境等因素造成的，至今還無確定結(jié)論。已有較多研究探討了不同層次的表觀調(diào)控對(duì)諸多代謝性疾病的影響，但是目前對(duì)T2DM的表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究較少[6]。因此，在研究糖尿病發(fā)病機(jī)制中，表觀轉(zhuǎn)錄變化很可能是一個(gè)重要方向。

N6-甲基腺苷(N6-Methyladenosine，m6A)是mRNA中豐度較高的表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控形式之一[7]。肥胖、糖尿病、癌癥和其他人類疾病等很多都與m6A修飾改變有關(guān)[8-9]。并且，m6A修飾是一種處于動(dòng)態(tài)過程的修飾[7，10]。一方面，甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(methyltransferase like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14(methyltransferase like 14，METTL14)和Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白(Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP)形成的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA中催化m6A[11-13]。另一方面，α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶蛋白家族的2個(gè)成員：脂肪和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)及α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶烷烴羥化酶同系物5(alk B homolog 5，ALKBH5)作為去甲基化酶，可以有效降低mRNA中m6A水平[10，14-16]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物和去甲基化酶相互制約，在細(xì)胞內(nèi)形成了對(duì)的m6A動(dòng)態(tài)調(diào)控。但對(duì)于T2DM中這些甲基化酶和去甲基化酶的表達(dá)是否變化？與T2DM發(fā)病有關(guān)的基因表達(dá)水平是否受其影響？這些問題還沒有相關(guān)研究。因此，本研究通過檢測(cè)T2DM患者m6A水平動(dòng)態(tài)變化，以及甲基化酶和去甲基化酶的差異表達(dá)，旨在探討表觀轉(zhuǎn)錄在T2DM發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2017年收治的60例T2DM患者(T2DM組，其中男性29例，女性31例，年齡52～64歲)和同期體檢的年齡、性別相匹配的65例健康人(健康對(duì)照組，其中男性32例，女性33例，年齡52～66歲)為研究對(duì)象。

1.2 外周血生化指標(biāo)檢查 采集所有研究對(duì)象空腹外周靜脈血2 ml，應(yīng)用全自動(dòng)Beckman AU5800生化分析儀測(cè)定其血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等生化指標(biāo)。

1.3 外周血總RNA的提取 應(yīng)用Blood RNA簡(jiǎn)易試劑盒(天根生化，北京)從外周血白細(xì)胞分離提取總RNA。使用微量分光光度計(jì)(Nano Drop)檢測(cè)RNA濃度，同時(shí)使用凝膠電泳法測(cè)定RNA完整性。另外，選取T2DM組低血糖急癥[(空腹血糖<2.5 mmol/L患者、空腹血糖正常(3.9～6.1 mmol/L)]和3例高血糖急癥(空腹血糖>22.5 mmol/L) T2DM患者進(jìn)行FTO mRNA表達(dá)量的測(cè)定。

1.4 RNA酶水解及總RNA m6A檢測(cè) 總RNA按Niand 描述的方法進(jìn)行酶解[17]。并采取液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)核苷進(jìn)行分析檢測(cè)，質(zhì)譜儀為AB 3200 QTRAP (Applied Biosystems，CA，USA)，在正相電噴霧電離模式下進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。用Mm6A與MrA的比值計(jì)算m6A的含量，其中Mm6A是m6A的摩爾量，而MrA是RNA樣品中測(cè)定的腺苷(A)的摩爾量。所有系數(shù)值(R2)均>0.998，線性范圍為0.05%～5.00%(m6A/rA的摩爾比)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 選用HepG2細(xì)胞系(本實(shí)驗(yàn)室自有)，對(duì)HepG2細(xì)胞分別用含有5.5 mM和16.7 mM的葡萄糖的培養(yǎng)基孵育48 h后，收集細(xì)胞，提取RNA備用。應(yīng)用Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)，DMEM中添加10%FBS(胎牛血清)和1%Pen-Strep(雙抗)。Lipofectamine(脂質(zhì)體)3000(Invitrogen，美國(guó))用于DNA質(zhì)粒(pcDNA3.1-FTO，篩選標(biāo)記為嘌呤霉素)和si-FTO轉(zhuǎn)染，si-FTO序列為5′-AAAUAGCCGCUGCUUGAGA-3′，并以序列為5′-UUCCGAACGUGUCACGUTT-3′的無義siRNA作為對(duì)照。應(yīng)用2 mg/L嘌呤霉素建立FTO敲除及過表達(dá)穩(wěn)定的細(xì)胞系。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 使用TRIzol試劑(invitrogen，美國(guó))提取細(xì)胞總RNA，之后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen，美國(guó))將其制備成cDNA文庫(kù)。在Q5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(ABI，美國(guó))上用相應(yīng)的引物和 PowerUp SYBR Green Master Mix(2x)試劑(Thermo Fisher，美國(guó))檢測(cè)FTO、METTL14、METTL3、FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2的mRNA表達(dá)。見表1。

表1 檢測(cè)mRNA相應(yīng)的引物

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 蛋白樣品在10% SDS-PAGE凝膠中分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉，在4℃下將膜與一抗[兔抗FTO(27226-1-AP，ProteinTech)、兔抗GAPDH(10494-1-AP，ProteinTech)]孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌3次后，膜在室溫下用二抗孵育2 h。化學(xué)發(fā)光法顯影，并用imageJ軟件檢測(cè)條帶相對(duì)灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用GraphPad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并作圖。將均數(shù)SE作為連續(xù)變量，用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各組變量的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM組血糖、血脂水平及甲基化酶和去甲基化酶改變 T2DM組患者空腹血糖、TC、TG及LDL-C水平顯著高于健康對(duì)照組，HDL-C低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。為觀察高糖刺激是否對(duì)mRNA甲基化和去甲基化的表達(dá)水平有所影響，qPCR檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)中部分患者和健康對(duì)照組的白細(xì)胞中METTL14、METLL3、WTAP和FTO的表達(dá)水平，結(jié)果顯示T2DM患者的METTL14、METLL3、FTO表達(dá)升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。但對(duì)用含有5.5 mM和16.7 mM的葡萄糖的培養(yǎng)基孵育的HepG2細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖刺激顯著提高了FTO mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，但是卻對(duì)METTL3、WATP和METTL14無明顯影響，見圖1B。總結(jié)以上數(shù)據(jù)，在T2DM患者和HepG2細(xì)胞中，葡萄糖刺激確實(shí)促進(jìn)了FTO的mRNA表達(dá)。但為何METTL3、WATP和METTL14在體內(nèi)和體外檢測(cè)不一致，可能是機(jī)體內(nèi)有更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。但首先明確高血糖可以直接刺激FTO表達(dá)的升高，為確定該結(jié)論，又分別檢測(cè)了3例低血糖急癥T2DM患者、高血糖急癥T2DM患者和空腹血糖正常健康對(duì)照者的FTO mRNA，結(jié)果顯示高血糖急診患者中FTO mRNA的表達(dá)水平明顯高于在低血糖急診的患者，見圖1C。

表2 T2DM組患者與健康對(duì)照組血糖和血脂水平比較

2.2 去甲基化酶FTO的升高導(dǎo)致m6A的含量下降 FTO是mRNA中m6A修飾的去甲基化酶之一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T2DM患者m6A含量明顯下降(P<0.01)，見圖2A，表明FTO在m6A下降中起重要作用。在HepG2細(xì)胞中檢測(cè)到類似的結(jié)果，即m6A在FTO敲除的細(xì)胞中隨FTO表達(dá)減少而增多，而m6A在FTO過表達(dá)細(xì)胞中隨FTO的表達(dá)增多而減少，見圖2B、圖2C。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明m6A含量的改變極大概率是由于FTO的操縱。 然而，在FTO過表達(dá)HepG2細(xì)胞中，METTL3、METTL14和WTAP的mRNA表達(dá)量無顯著的變化，見圖2D。這些結(jié)果的差異顯示了FTO對(duì)mRNA甲基化以及其它m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的影響在體內(nèi)存在復(fù)雜的發(fā)生機(jī)制。

注：圖1A：T2DM患者和對(duì)照組甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶 mRNA的表達(dá)；圖1B：高糖刺激HepG2細(xì)胞后，F(xiàn)TO mRNA表達(dá)含量的變化；圖1C：FTO mRNA在3例空腹正常血糖患者(P1～P3)(空腹血糖<3.9～6.1 mmol/L)和3例空腹低血糖患者(P4～P6)(空腹血糖<2.5 mmol/L)和3例高血糖急癥患者(P7～P9)(空腹血糖>22.5 mmol/L)中表達(dá)情況，以正常血糖的第一位患者的FTO mRNA相對(duì)表達(dá)量為基準(zhǔn)。與對(duì)照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01。圖1 高血糖促進(jìn)FTO mRNA表達(dá)

注：圖2A：T2DM病人和正常人血液白細(xì)胞中m6A含量值的變化；圖2B：在敲出或過表達(dá)FTO的HepG2細(xì)胞中，m6A含量值的變化；圖2C：在敲出或過表達(dá)FTO的HepG2細(xì)胞中FTO蛋白表達(dá)的Western blot分析；圖2D：FTO過度表達(dá)HepG2細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，*：P<0.05。圖2 高血糖和FTO敲低或過表達(dá)后HepG2細(xì)胞中m6A和甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況

2.3 觀察 FTO對(duì)FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2的mRNA表達(dá)的影響 為了探究T2DM患者中FTO與調(diào)控糖脂代謝的關(guān)鍵基因之間的關(guān)系，qPCR法檢測(cè)了FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2的mRNA表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示，在T2DM患者中，F(xiàn)OXO1、FASN、G6PC、DGAT2的相對(duì)mRNA表達(dá)水平均比對(duì)照組高，見圖3A。為了再次驗(yàn)證FTO的調(diào)控作用，在FTO被敲除的HepG2細(xì)胞中，F(xiàn)XO1和DGAT2的mRNA表達(dá)水平顯著降低，見圖3B。此外，F(xiàn)XO1、FASN、G6PC和DGAT2在FOT過度表達(dá)HepG2細(xì)胞中表達(dá)有一定程度的升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3C?？偨Y(jié)這些數(shù)據(jù)，對(duì)于這些基因的正常調(diào)控，F(xiàn)TO是非常必要的。

注：圖3A：T2DM患者和正常人的FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2的mRNA表達(dá)水平；圖3B：FTO敲除HepG2細(xì)胞中FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2的mRNA表達(dá)(n=3)；圖3C：FTO過表達(dá)HepG2細(xì)胞中FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2的mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01。圖3 FTO誘導(dǎo)脂質(zhì)和葡萄糖代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)

3 討論

真核細(xì)胞中存在一種可逆的、廣泛的mRNA修飾-m6A修飾，表達(dá)異常的m6A修飾會(huì)導(dǎo)致mRNA的功能發(fā)生障礙，這可進(jìn)一步引發(fā)動(dòng)物和人的許多疾病[18]。T2DM嚴(yán)重危害我國(guó)公眾的健康安全問題，具有很高的發(fā)病率，據(jù)有關(guān)研究顯示，到2020年我國(guó)的T2DM患者可能會(huì)達(dá)到8000萬[19]。然而，對(duì)于RNA的表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控改變?cè)赥2DM病理過程中的作用和影響，現(xiàn)在對(duì)此知之甚少。在高血糖的影響下，細(xì)胞的mRNA甲基化水平有什么改變，以及這種改變的機(jī)制是怎樣的，相關(guān)研究都還比較缺乏。本研究表明，T2DM患者的外周血白細(xì)胞m6A修飾呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，T2DM患者去甲基酶FTO mRNA表達(dá)與m6A水平相反。為了再次證實(shí)T2DM高血糖急癥患者FTO mRNA表達(dá)可能會(huì)明顯比低血糖急癥患者升高，通過對(duì)選取的正常血糖、高血糖急癥和低血糖患者的數(shù)據(jù)分析表明，高血糖和病人FTO表達(dá)水平之間的關(guān)系，同時(shí)，在體外的HepG2細(xì)胞高糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其更直觀地展現(xiàn)了葡萄糖有促進(jìn)FTO表達(dá)的作用。這些結(jié)果顯示高糖會(huì)促進(jìn)FTO的表達(dá)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)m6A在T2DM中的降低作用。同時(shí)，檢測(cè)T2DM患者血樣中幾種甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，T2DM患者M(jìn)ETTL3和METTL14 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組。但在體外的高血糖刺激實(shí)驗(yàn)中，并未發(fā)現(xiàn)METTL3和METTL14 mRNA表達(dá)水平有顯著的變化。同時(shí)，在過表達(dá)的FTO細(xì)胞中也觀察不到METTL3和METTL14 mRNA表達(dá)水平含量有顯著的改變。這種差異表明高血糖對(duì)RNA的m6A修飾表達(dá)調(diào)控水平，在體內(nèi)有著更為復(fù)雜的機(jī)制。但是無論在體內(nèi)還是體外我們都可以看到較高的FTO表達(dá)水平和降低的m6A含量之間有著很明顯的關(guān)聯(lián)。

在T2DM的病理過程中，F(xiàn)OXO1、FASN、G6PC和DGAT2是參與糖脂代謝的重要酶，有著非常重要的作用[20-24]。本研究T2DM患者FTO mRNA表達(dá)上升與FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2 mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)，并且雖然在FTO過表達(dá)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中沒有看到明顯的增強(qiáng)作用，但在FTO敲除的HepG2細(xì)胞中觀察到對(duì)應(yīng)一致的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TO可能提高FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2 mRNA表達(dá)水平。在來自HepG2細(xì)胞的m6A-Seq的數(shù)據(jù)中表明，F(xiàn)XO1有5個(gè)m6A位點(diǎn)，F(xiàn)ASN有2個(gè)m6A位點(diǎn)[25]，并且抑制m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，顯著影響基因的表達(dá)和選擇性剪接方式，在這些基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中表明m6A起著重要作用。因此，通過充當(dāng) m6A“橡皮擦”的FTO可以用來調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)水平。而這些基因能夠進(jìn)一步影響葡萄糖和脂質(zhì)的代謝。尤其是，在糖異生和糖原分解中，G6PC是其中的關(guān)鍵酶，F(xiàn)OXO1還促進(jìn)肝糖的異生，這在很大程度上表明了T2DM患者的血糖升高與代謝酶的mRNA甲基化調(diào)控相聯(lián)系[26]。另一種可能的機(jī)制是胰島素抵抗(IR)。FOXO1是Forkhead家族的成員，在胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，作為極其必要的轉(zhuǎn)錄因子，在所有組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)[27]。FASN是一種脂肪酸合成酶，可以催化形成新的脂肪酸，其在代謝性疾病中可以通過IR發(fā)揮關(guān)鍵的作用[28]。而在小鼠肝臟中DGAT2的過度表達(dá)，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的肝臟IR。所以這些基因的升高必然會(huì)影響葡萄糖和脂質(zhì)的代謝水平。

綜上所述，高糖刺激可以增加FTO表達(dá)水平，從而導(dǎo)致m6A水平降低，T2DM病人的FOXO1、FASN、G6PC和DGAT2的mRNA表達(dá)水平顯著升高，并且FTO敲低后FOXO1和DGAT2的mRNA表達(dá)水平顯著降低，表明FTO這些基因mRNA的水平有明顯影響。但高血糖是怎么刺激FTO水平增加，其體內(nèi)機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究。

致謝：該項(xiàng)目得到河南省自然科學(xué)基金“Sirt6經(jīng)LKB1/AMPK/PGC1a/NRF上調(diào)線粒體生物合成”(編號(hào)202300410325)支持。

說明：本次研究對(duì)象選取南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的病例，是因?yàn)楣P者單位與南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院有合作。