王豪,黃永毅,李保生,元輝雄,莫麗娟,龐金鳳,李晴紅,盧順,楊彩艷
(1. 泰州學(xué)院江蘇省手性醫(yī)藥化學(xué)品生物制造重點實驗室,江蘇 泰州 225300;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;3. 廣西河池市東蘭縣人民醫(yī)院,廣西 東蘭 547400)
獼猴桃屬是獼猴桃科植物中經(jīng)濟價值最大的植物,目前發(fā)現(xiàn)獼猴桃屬植物有54個以上品種,優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)中國擁有的品種超過52個;其果實多汁、營養(yǎng)成分豐富并具有甜酸適口和風(fēng)味獨特等優(yōu)點,素有“果中之王”的美譽[1-2]?!侗静菥V目》和《中華本草》均揭示獼猴桃:果實味甘、酸,性寒,歸胃、肝、腎經(jīng),具有調(diào)中下氣、生津潤燥、清熱利尿、健胃通便的作用;根味微甘、澀,性涼,有小毒,具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、活血消腫的功效;藤味甘、性寒,具有和中開胃、清熱利濕的藥效;枝葉味微苦、澀,性涼,功善清熱解毒、散瘀止血;全株味淡、澀,性平,民間用于治療高血壓病、偏癱、瘡癤等疾病[3-5]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明中華獼猴桃根具有抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗炎、抗氧化和保肝、降血脂、提高免疫力等多種活性[6-9];獼猴桃果實具有降血壓、血脂、抗氧化、抗炎、改善血液流變學(xué)等輔助防治動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)藥效[10-12]。
廣西是中國獼猴桃優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)之一,境內(nèi)分布有中華、美味、軟棗、圓果、黑蕊等多種獼猴桃(Actinidia chinensis,A. deliciosa,A. arguta,A. globosa,A . melanandra)[1]。為了提高壯藥獼猴桃的臨床應(yīng)用價值,使用家兔模型于實驗開始及實驗結(jié)束時分析超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量、血脂五項和血液流變學(xué)指標(biāo),通過病理切片觀察主動脈弓病理形態(tài),評價獼猴桃全株、果實對AS的預(yù)防作用。結(jié)果表明獼猴桃全株乙醇-水提取物具有較好地預(yù)防血脂升高和改善血液流變學(xué)藥效而獼猴桃果實具有較好抗氧化和一定預(yù)防血脂升高作用;降血脂、抗氧化、改善血液流變學(xué)是抗動脈粥樣硬化重要的藥效基礎(chǔ),動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ),心腦血管疾病是人類主要死亡原因之一。由此可知,獼猴桃通過對預(yù)防早期動脈粥樣硬化的形成從而對心腦血管疾病具有一定的預(yù)防作用,除其果實具有較高的食用價值外,其全株還具有較高的藥用價值[13-14]。
1.1 材料 獼猴桃(Actinidia chinensis)全株于2018年9月26日采自廣西樂業(yè)縣,由右江民族醫(yī)學(xué)院黃元河副教授鑒定為中華獼猴桃;果實為樂業(yè)紅心獼猴桃(中華獼猴桃與美味獼猴桃接穗選育品種)于2018年8月15日采自廣西樂業(yè)縣[15]。總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒購自麥克生物股份有限公司,SOD檢測試劑盒購自美康科技生物股份有限公司。新西蘭家兔(2.25±0.25) kg購自廣西田東隆祥兔業(yè)有限公司(動物質(zhì)量合格證編號:0008757)。動物實驗在右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心完成,實驗條件:室溫(24±5)℃,相對濕度(75±15)%。
1.2 儀器 B-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀是步琦實驗室設(shè)備公司生產(chǎn),F(xiàn)A1204B電子分析天平是上海精科天美儀器有限公司生產(chǎn),SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、DLSB-5/10低溫冷卻液循環(huán)泵是鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn),7600-020型全自動生化分析儀Hitachi、SA9000自動錐板式血液流變分析儀是北京賽科希德科技發(fā)展有限公司生產(chǎn),Motic BA210數(shù)碼生物顯微鏡和Motic BA600虛擬掃描切片系統(tǒng)是麥克奧迪公司生產(chǎn)。
1.3 藥物提取及髙脂飼料配方 依次使用90%乙醇(室溫、3次、3天/次)和50%乙醇 (室溫、3次、3天/次)和沸水(2次、0.5小時/次) 分別提取中華獼猴桃全株和樂業(yè)紅心獼猴桃果實;分別將兩種藥材提取液混合減壓濃縮得獼猴桃全株和果實提取物。髙脂飼料按膽固醇1% 、豬油8%、蛋黃4%和基礎(chǔ)飼料87%調(diào)配[16]。
1.4 AS動物模型復(fù)制及活性指標(biāo)檢測 將24只雌雄各半新西蘭家兔給予基礎(chǔ)顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分為正常組、模型組和實驗組(每組8只,雌雄各半)。正常組喂飼正常飼料,模型組喂食高脂飼料,實驗組喂食高脂飼料和果實及全株提取物(果實給藥量:每天每只給予22 g鮮果的提取物,全株給藥量:每天每只給予7.3 g陰干藥材的提取物);每只家兔每日進食量均為120 g,單籠喂養(yǎng),自由飲水,連續(xù)喂養(yǎng)60 d。于實驗開始0 d和60 d禁食12 h后耳緣靜脈采血5 ml,經(jīng)干燥肝素鈉管外加0.4 ml 0.1 mg/ml肝素鈉抗凝,血樣用于血脂五項、血液流變學(xué)及血漿中SOD含量檢測。60 d取血結(jié)束后從耳緣靜脈按4 ml/kg注射25%烏拉坦麻醉,沿腹正中線切開,迅速取出心臟及主動脈,將主動脈從心臟與主動脈連接的位置及髂動脈分支處剪斷,離體后縱向剪開主動脈并剝離動脈外膜,標(biāo)本予10%中性福爾馬林溶液固定,待蘇丹Ⅳ染色及病理檢查。
1.5 動物觀察及活性指標(biāo)檢測 每天觀察家兔的精神狀態(tài)、行為活動、毛色、飲食、飲水、糞便等情況,分別于實驗0 d、30 d和60 d稱體重1次,每周測體溫1次,計算每組體重變化。用SA9000自動錐板式血液流變分析儀測定全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)、全血高切相對指數(shù)、全血低切相對指數(shù)等血液流變學(xué)指標(biāo)。用全自動生化分析儀測定血脂五項(TC、TG、LDL-C、VLDL-C和HDL-C)及SOD活力。用石蠟包埋主動脈,切片、HE染色后在透射電子顯微鏡下觀察并用Motic BA600虛擬掃描切片系統(tǒng)掃描。
2.1 動物一般狀況 實驗中家兔健康狀況良好,實驗期間未發(fā)生家兔死亡情況,各組家兔精神狀態(tài)、體溫變化、行為活動、毛色、飲食、飲水、糞便未見明顯異常。實驗前,正常組、模型組、果實組及全株組的家兔體重分別為(2.47±0.16) kg、(2.44±0.15) kg、(2.49±0.14) kg、(2.48±0.10) kg,實驗前各組家兔體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.140,P=0.935);實驗后,正常組、模型組、果實組及全株組的家兔體重分別為(2.90±0.09) kg、(3.35±0.14) kg、(3.05±0.09) kg,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.544,P<0.001),體重增長速度正常組小于其它各組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,正常組外其它各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2 獼猴桃全株及果實對AS家兔血脂及SOD含量的影響 對家兔血脂及SOD含量影響見表1,由表可知:實驗開始前各組間血脂水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義;實驗結(jié)束時模型組TG、TC、LDL-C和HDL-C均較正常組明顯升高,兩組比較差異具有統(tǒng)計意義(P<0.01);果實組中TC、LDL-C和HDL-C變化均介于正常組和模型組之間,與正常組相比其TC、LDL-C和HDL-C差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,與模型組相比除VLDL-C外差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與實驗開始時相比,實驗結(jié)束時全株組中TG、TC、LDL-C和VLDL-C變化同樣介于正常組和模型組之間,除VLDL-C外其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義,但SOD值變化不明顯且無統(tǒng)計意義。全株組與果實組相比,TG升高程度差別不大,TC、LDL-C與HDL-C升高程度明顯小于果實組,VLDL-C升高程度大于果實組。實驗開始時各組SOD含量無明顯差異,其差異無統(tǒng)計學(xué)意義;實驗結(jié)束時模型組與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,果實組和其它各組差異都非常明顯,與正常組和模型組的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義,全株組與正常組和模型組差異都不明顯且其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
表1 獼猴桃全株及果實對動脈粥樣硬化家兔SOD及脂質(zhì)代謝的影響
表1(續(xù)) 獼猴桃全株及果實對動脈粥樣硬化家兔SOD及脂質(zhì)代謝的影響
2.3 獼猴桃全株及果實對AS家兔血液流變學(xué)的影響 實驗開始前取同樣血量(5 ml),各組所需時間差異不大;實驗結(jié)束時模型組時間明顯延長。血液流變學(xué)活性測試中除少量血樣凝固無法測試外,其余血樣對家兔血液流變學(xué)的影響,見表2。由表2可知實驗開始時各組差異不大;結(jié)束時除全血低切相對指數(shù)外,其余各項中果實組和全株組的值都介于正常組和模型組之間,大部分全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)及全血高切相對指數(shù)都明顯低于模型組;和正常組相比,除全血黏度/mPa·s(30.00 s-1)和血漿黏度外,其余差異均具有統(tǒng)計意義,全株組除全血黏度/mPa·s(200.00 s-1)外,其余差異不明顯且其差異無統(tǒng)計意義,果實組除各項全血黏度、血漿黏度其差異無統(tǒng)計意義外,其余差異明顯且具有統(tǒng)計學(xué)意義;和模型組相比,全株組中除血漿黏度外各項差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),果實組中紅細胞聚集指數(shù)、全血高切相對指數(shù)其差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義。
表2 獼猴桃全株及果實對動脈粥樣硬化家兔血液流變學(xué)的影響
表2(續(xù)) 獼猴桃全株及果實對動脈粥樣硬化家兔血液流變學(xué)的影響
2.4 獼猴桃全株及果實對主動脈管腔的影響 心臟主動脈形態(tài)學(xué)結(jié)果,見圖1,結(jié)果表明正常組家兔心臟主動脈管腔光滑完整、內(nèi)膜光滑、內(nèi)皮細胞排列規(guī)整、無粥樣病損、無脂質(zhì)條紋及斑塊形成;大部分模型組家兔主動脈內(nèi)膜粗糙不平,有大量黃白色條紋狀脂紋及斑塊,向內(nèi)膜表面顯著隆起;大部分果實組家兔主動脈內(nèi)也粗糙不平,有較多脂質(zhì)條紋形成,與模型組差別不大;大部分全株組家兔主動脈官腔比較光滑,只有少量內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞,內(nèi)皮細胞形態(tài)異常及微量黃白色條紋狀脂紋形成,與正常組相差不大。
TG、TC、LDL-C濃度過高是導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成的重要因素;HDL-C對動脈有保護作用,對動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。實驗中發(fā)現(xiàn)家兔血液中HDL-C濃度隨TG、TC和LDL-C變化而成同向變化,這可能與機體正常的免疫應(yīng)答有關(guān),當(dāng)機體遭受致病因素侵襲時機體會調(diào)動自身的免疫系統(tǒng)與之對抗,最終疾病是否發(fā)生發(fā)展則取決于雙方強弱的程度。獼猴桃果實和全株均在一定程度上能預(yù)防因高脂飲食導(dǎo)致血脂升高的藥效但難于評價兩者藥效優(yōu)劣。
注:A為正常組;B為模型組;C為果實組;D為全株組。圖1 各組家兔主動脈形態(tài)學(xué)結(jié)果比較
SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員,在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用;從實驗結(jié)束時模型組和正常組相比,SOD值差異不具有統(tǒng)計意義表明通過髙脂喂養(yǎng)2月齡家兔2個月很可能對其抗氧化能力沒有產(chǎn)生損害;2月齡家兔已經(jīng)具備生育能力,機體很可能也開始了正常氧化衰老過程。果實組SOD值與正常組和模型組差異都非常明顯且具有統(tǒng)計意義則表明獼猴桃果實具有較好地抗氧化作用,很可能具有延緩成年動物和人群衰老速度的功效。
通過高脂喂食可以導(dǎo)致家兔血液黏度明顯升高,獼猴桃全株具有較好預(yù)防高脂飲食導(dǎo)致高黏血癥的藥效,果實藥效不明顯。
動脈粥樣硬化的形成與氧化應(yīng)激、炎癥、高血脂癥和高黏血癥等多種因素有關(guān),因此中藥中有抗氧化、抗炎、降血脂和改善血液流變學(xué)藥效成分均可能與其它成分發(fā)揮協(xié)同作用,阻斷、延緩動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展及治療動脈粥樣硬化疾病。樂業(yè)紅心獼猴桃為四川紅陽獼猴桃(中華獼猴桃的一個變種)和廣西樂業(yè)縣的美味獼猴桃接穗選育,其果實在本次動物實驗中雖然表現(xiàn)出較強的抗氧化作用和一定的降血脂作用,但從主動脈弓形態(tài)學(xué)來看其預(yù)防早期動脈粥樣硬化(血管內(nèi)壁脂肪紋形成)形成活性較弱;其原因可能是實驗中動物已經(jīng)食用肥甘厚膩的高脂飼料,其果實本身味甘,雖然具有一定降血脂作用,但不利于血液流動,從而導(dǎo)致脂質(zhì)在血管內(nèi)壁聚集及其預(yù)防動脈粥樣硬化早期形成活性較弱。獼猴桃果實與莖、枝、葉配伍后全株味淡,根據(jù)中藥味淡利濕滲濕的藥性規(guī)律,推測其一方面通過降低血液中血脂含量(降血脂),另一方面加速血脂滲透(改善血液流變學(xué))使之通過尿液排出,阻止脂肪在動脈內(nèi)部聚集,從而達到預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生的藥效。