草魚呼腸孤病毒抗原捕獲ELISA檢測方法的建立

景宏麗，曹 歡，張 旻，王 娜，林祥梅，張利峰，吳紹強(qiáng)

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029；

2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100021；3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 101113）

草魚呼腸孤病毒抗原捕獲ELISA檢測方法的建立

景宏麗1，曹 歡2，張 旻1，王 娜1，林祥梅1，張利峰3，吳紹強(qiáng)1

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029；

2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100021；3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 101113）

研究以純化的羊抗草魚呼腸孤病毒多克隆抗體作為捕獲抗體，抗草魚呼腸孤病毒的單克隆抗體為檢測抗體，建立草魚呼腸孤病毒抗原捕獲ELISA檢測方法，其最佳反應(yīng)條件是：羊多克隆抗體包埋濃度為2.5μg/ mL，抗草魚呼腸孤病毒單克隆抗體工作濃度為1∶400稀釋，以3%牛血清白蛋白作為封閉液。該方法的檢測限為5×105pfu/mL，且能夠特異性檢出發(fā)病草魚內(nèi)臟組織中的草魚呼腸孤病毒。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有較高的特異性，與病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和鯉春血癥病毒等水產(chǎn)動(dòng)物病毒株均不反應(yīng)。該方法還具有較好的穩(wěn)定性。

草魚呼腸孤病毒；抗原捕獲ELISA；單克隆抗體

草魚呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）是中國分離到的第一株魚類病毒，是草魚出血病的主要病原。草魚出血病發(fā)病季節(jié)長，流行范圍廣，防治方法有限。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年由于草魚出血病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)21.36億元[1-2]。

該病毒為20面體的球形顆粒，直徑為70-80nm，具雙層衣殼，無囊膜。病毒基因組為雙股RNA，由11條片段組成[3]。據(jù)數(shù)據(jù)，目前在患有草魚出血病病魚中已經(jīng)分離到了多種草魚呼腸孤病毒，包括GCRV873，GCRV875，GCRV HZ08，

GCRVD108和AGCRV等。有些學(xué)者認(rèn)為這些草魚呼腸孤病毒株在毒力水平、細(xì)胞培養(yǎng)特性和免疫抗原性都具有較大的差異性[4-8]。

魚類的病毒病通常是以“預(yù)防”為主，只有建立快速、敏感、特異的草魚出血病診斷技術(shù)并應(yīng)用到實(shí)際防治工作中去才能真正做到這一點(diǎn)。目前基于草魚呼腸孤病毒的多樣性，只能先建立一種研究最為成熟的草魚呼腸孤病毒的檢測方法，然后推廣，并比較病毒株之間差異，以期能夠建立一種能夠真正預(yù)防草魚出血病的檢測方法。

GCRV873株，曾是我國南方草魚養(yǎng)殖地區(qū)草魚出血病的主要病原，也是我國研究最早的一株病毒株，檢測方法也較為全面，主要包括電鏡觀察法、各種PCR法[9-10]、細(xì)胞分離法和逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）法[11-12]。這些方法都各有一定的不足，如檢測時(shí)間長、操作復(fù)雜和依賴貴重儀器等。本研究旨在建立一種抗原捕獲ELISA檢測法，并初步應(yīng)用該ELISA方法檢測草魚出血病病患魚的組織。

1 材料與方法

1.1 病毒株和細(xì)胞系

草魚呼腸孤病毒湖南株（GCRV873）由武漢病毒所提供；對(duì)照毒株：鯉春血癥病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV）和傳染性造血器官壞死病毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）由英國Weymouth的OIE參考實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；傳染性胰臟壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）由丹麥Ahus的OIE參考實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)；流行性造血器官壞死病毒（ epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV）由澳大利亞OIE參考實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；大馬哈魚病毒（Chum salmon reovirus，CSV）和病毒性出血性敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）由本實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)中所用細(xì)胞系有藍(lán)鰓太陽魚細(xì)胞（BF-2）、草魚卵巢細(xì)胞（CO）、草魚腎細(xì)胞（CIK）、鮭囊胚細(xì)胞（CHSE）、胖頭鱥肌肉細(xì)胞（FHM）、鯉上皮瘤細(xì)胞（EPC）、虹鱒肝細(xì)胞（R1）、虹鱒性腺細(xì)胞（RTG-2），均用含10%胎牛血清的199培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 抗體和其他試劑

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的抗草魚呼腸孤病毒的單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備[13]；硫酸鹽（TMB），購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig），購自SIGMA公司；其他試劑為國產(chǎn)化學(xué)試劑。

1.3 草魚呼腸孤病毒（GCRV）的制備

將貼壁生長狀況良好的鯉魚上皮瘤細(xì)胞（EPC）于75cm3細(xì)胞培養(yǎng)瓶中傳代（每瓶加入約12mL培養(yǎng)液），置25℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取生長24h以內(nèi)且已經(jīng)長滿單層的細(xì)胞接種GCRV病毒懸液，接種量為0.2mL/瓶。然后，置25℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞，直至出現(xiàn)100%細(xì)胞病變（CPE），即細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，完全脫落，且懸浮病毒合胞體。收集病毒懸液-80℃保存且標(biāo)定收集到病毒懸液的TCID50/0.1mL。

1.4 羊抗草魚呼腸孤病毒多克隆抗體的制備和純化

上述收集到的病毒懸液，以8000r/min離心35min，收集上清；24000r/min離心2h，收集沉淀作為為抗原，分別多點(diǎn)注射免疫山羊，每周一次，共4次；取血清，分裝，-80℃保存。

采用飽和硫酸銨法純化羊抗GCRV多克隆抗體：羊血清與0.01mol/L的PBS等體積混合4℃不停攪拌，逐漸加入飽和硫酸銨終濃度為35%。4℃下，攪拌1h。9000r/min離心20min。收集沉淀，用0.01mol/L的PBS重懸。4℃不停攪拌，逐漸加入飽和硫酸銨終濃度為45%。4℃下，攪拌1h。9000r/min離心20min。收集沉淀，用0.01mol/L的PBS重懸。把溶液裝入到透析袋中，在0.01mol/ L的PBS中透析24h。離心，分裝，即得到純化的山羊IgG。

1.5 ELISA方法的建立和優(yōu)化

1.5.1 方法基本程序[10]

（1）包埋純化的羊多克隆抗體，每孔100μL，4℃過夜；

（2）洗滌：用PBST洗滌ELISA板3次，每次2min，甩干；

（3）封閉：加3﹪BSA，置37℃，60min；

（4）加樣：待測樣品、陽性樣品和陰性樣品，每孔100μL，37℃反應(yīng)90min；

（5）洗滌：用PBST洗滌3次，每次2min，甩干；

（6）一抗：每孔加抗GCRV的單克隆抗體100μL，37℃反應(yīng)90min；

（7）洗滌：用PBST洗滌3次，每次2min，甩干；

（8）去非特異性過氧化物酶：加0.1%H2O2，每孔300μL，37℃反應(yīng)15min；

（9）洗滌：用PBST洗滌3次，每次2min，甩干；

（10）二抗：每孔加100μL辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記小鼠抗山羊IgG作二抗，37℃反應(yīng)90min；

（11）洗滌：用PBST洗滌3次，每次2min，甩干；

（12）顯色：每孔加100μL顯色劑，室溫暗處避光反應(yīng)5min，陽性顯色，陰性未顯示時(shí)終止；

（13）終止：每孔加150μL2M H2SO4終止反應(yīng)；

（14）酶標(biāo)儀測定：測定波長為450 nm時(shí)各孔的吸光度（A）值，計(jì)算陽性血清與陰性血清光吸收值之比（P/N），當(dāng)P/N≥2.1時(shí)判定為陽性。

1.5.2 抗體最佳濃度確定

包埋純化的羊抗IgG（10μg/mL；5μg/ mL；2.5μg/mL；1.25μg/mL），鼠抗GCRV單克隆抗體（1∶400；1∶800；1∶1600），病毒抗原（V0：5×106pfu/mL；V1：5×105pfu/mL；V2：5×104pfu/mL），棋盤滴定方法進(jìn)行上述ELISA實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 特異性試驗(yàn)

其他水生動(dòng)物病毒包括IHNV、SVCV、VHSV、IPNV和CSV（濃度均為5×106pfu/mL）及其增殖用水生動(dòng)物細(xì)胞系作為待檢測樣品，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。

1.5.4 敏感性試驗(yàn)

檢測抗原GCRV濃度均為5×106pfu/mL，10倍系列稀釋，進(jìn)行ELISA檢測。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

所有ELISA中的試劑，在10℃和37℃分別放置3d、6d和9d，進(jìn)行ELISA檢測。

1.6 ELISA方法的應(yīng)用

在某單位獲得患有草魚出血病的魚類內(nèi)臟組織樣品3份，分別進(jìn)行ELISA和PCR檢測。PCR方法依照檢測草魚出血病的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T3584-2013）進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 抗體最佳濃度確定

包埋純化羊抗和鼠單克隆抗體最適濃度的確定，根據(jù)P/N值最大，且保證病毒檢測的敏感度最高，確定包埋羊多克隆抗體濃度為2.5μg/ mL，鼠單克隆抗體濃度為1∶400（表1）。

表1抗體最適濃度的確定（P/N值）

2.2 特異性

在特異性實(shí)驗(yàn)中，ELISA方法特異性較高，與多株病毒株和細(xì)胞株發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只與GCRV反應(yīng)，即P/N值為5.18；而與其他病毒株和細(xì)胞株均不發(fā)生反應(yīng)（表2）。

表2特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（P/N值）

2.3 敏感性

建立的ELISA方法最低能夠檢測到5×105pfu/ mL（表3）。

表3敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（P/N值）

2.4 穩(wěn)定性

在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，ELISA方法中所有試劑在

10℃和37℃穩(wěn)定性比較好，表4所示，陽性樣品和陰性樣品的相關(guān)數(shù)據(jù)，其他試劑的數(shù)據(jù)未列出。在參與國家認(rèn)監(jiān)委組織的2013年能力驗(yàn)證項(xiàng)目，19個(gè)實(shí)驗(yàn)室均能夠達(dá)到滿意標(biāo)準(zhǔn)，也進(jìn)一步證明了ELISA檢測方法的具有較好的穩(wěn)定性。

表4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 ELISA方法的應(yīng)用

在某單位獲得草魚出血病樣品（分別命名為1、2、3），ELISA結(jié)果顯示3個(gè)樣品均為陽性（表5），而根據(jù)GCRV行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示只有2和3為陽性樣品（圖1）。

表5 ELISA檢測樣品結(jié)果（P/N值）

圖1 RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

本次試驗(yàn)所用的抗GCRV單克隆抗體經(jīng)用Western-blotting和間接ELISA分析其特性，證明單克隆抗體具有針對(duì)GCRV的特異性[13]。試驗(yàn)中采用的兩種特異性抗體，形成了“抗GCRV羊多克隆抗體-GCRV抗原-抗GCRV單克隆抗體”的夾心結(jié)構(gòu)，提高了抗原抗體反應(yīng)特異性，減少了假陽性結(jié)果。另外采用方陣滴定法對(duì)抗體濃度進(jìn)行了相關(guān)優(yōu)化，提高了反應(yīng)靈敏度。

抗原捕獲ELISA檢測方法中所有試劑在10℃和37℃在9天內(nèi)穩(wěn)定性都比較好，但是從結(jié)果上可以明顯看出放在10℃時(shí)的穩(wěn)定性更好。在后期研究中，本實(shí)驗(yàn)室還進(jìn)行在10℃放置30天的穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果顯示仍有較強(qiáng)的陽性反應(yīng)，表明建立的抗原捕獲ELISA方法穩(wěn)定性較好，更長時(shí)間的穩(wěn)定性研究還在進(jìn)行中。

試驗(yàn)中應(yīng)用的抗原捕獲ELISA方法對(duì)具有明顯癥狀的草魚，3份肝、脾和腎等內(nèi)臟混合組織進(jìn)行檢測，結(jié)果表明3份樣品含有GCRV病毒。在進(jìn)行ELISA方法的同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)檢測草魚出血病的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T3584-2013）進(jìn)行了PCR檢測，結(jié)果只有2份樣品為陽性。抗原捕獲ELISA方法結(jié)果與PCR方法結(jié)果有一定的差異。這一差異盡管不能說明在對(duì)具有發(fā)病癥狀的草魚內(nèi)臟組織進(jìn)行檢測抗原捕獲ELISA方法的準(zhǔn)確性優(yōu)于PCR檢測方法，但是至少能夠說明建立的抗原捕獲ELISA方法能夠特異性的檢測具有明顯發(fā)病癥狀草魚的中攜帶的GCRV。由于草魚出血病的爆發(fā)是有時(shí)間性的，采集發(fā)病魚類的樣品就有一定的限制性，因此建立的抗原捕獲ELISA方法準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步研究，而抗原捕獲ELISA方法與PCR方法的比較也需要進(jìn)一步研究。

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Establishment of Antigen-Capture ELISA for Detection of Grass Carp Reovirus

Jing Hongli1，Cao Huan2，Zhang Min1，Wang Na1，Lin Xiangmei1，Zhang Lifeng3，Wu Shaoqiang1*

（1. Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 10002；2. Beijing Aquiculture Technology Extension Station，Beijing 100021；3. Research Centre of Aquatic Animal Diseases，Beijing Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 101113）

An antigen-capture enzyme-linked immunoassay（ELISA）was developed for the detection of grass carp reovirus（GCRV）with purifed polyclonal antiserum against GCRV as capture antibody and monoclonal antibodies against GCRV as detection antibody. The 96-well enzyme immunoassay（EIA）plates were coated with 100μL purifed polyclonal antiserum at concentration of 2.5μg /mL and blocked with 3% bovine serum albumin（BSA）. The working concentration of monoclonal antibody was diluted to 1：400 with distilled water. GCRV was detected in culture supernatants（5×105pfu/mL）and in the extracts of kidney and spleen of infected grass carp. The assay was highly specifc：viral hemorrhagic septicemia virus，infectious haematopoietic necrosis virus，spring viraemia of carp virus，epizootic haematopoietic necrosis virus，chinook salmon reovirus could not be detected by the developed ELISA and the method was also of good stability.

grass carp reovirus；antigen-capture ELISA；monoclonal antibody

S941.41

：A

：1005-944X（2014）12-0078-05

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目《重大外來與新發(fā)水生動(dòng)物疫病識(shí)別與監(jiān)測技術(shù)研究及示范》（2013BAD12B02）

吳紹強(qiáng)