滸苔低聚糖的制備及抗氧化活性研究

胡馨月，張維，趙行，李若敏，周振，胡圣男，盤賽昆，2，3，4*

（1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 連云港 222005；3.江蘇海洋大學江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；4.江蘇海洋大學江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

滸苔（Enteromorpha spp.），俗稱苔條，屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科滸苔屬藻類植物，主要成分是多糖類和粗纖維，營養(yǎng)價值豐富，具有獨特的風味，深受消費者的喜愛[1-2]，目前已廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)[3-4]。多糖（polysaccharides）是由單糖通過糖苷鍵以線性或分支的方式連接而成，是構(gòu)成生命活動的重要大分子化合物[5]，具有多種生理活性[6]，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和增強免疫力等[7-8]。

低聚糖（oligosaccharides）是由少數(shù)分子的單糖（2個～10 個）縮合而形成的，又稱寡糖[9]，具有降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強免疫力、抗氧化等生物活性。 其結(jié)構(gòu)簡單、分子量較小，具有低熱量、穩(wěn)定性好、無毒等良好的特性，在對人體的免疫性及預(yù)防疾病等方面發(fā)揮重要作用[10]。 低聚糖還具有很好的抗氧化性[11]，在保護水果風味、色澤及維生素方面十分有利。 低聚糖普遍存在于自然界，主要來源于植物，通常以天然植物多糖進行降解得到。 低聚糖制備方法有酶解、酸解、物理降解、酶縮合等[12-14]。 酸解法是最簡單有效的一種降解方法，糖苷鍵容易在酸性條件下斷裂，從而將多糖大分子裂解為不同聚合度的分子片段。 控制酸的濃度、反應(yīng)時間和溫度，可調(diào)整多糖降解的程度，從而得到目標分子量的寡糖混合物[15]。

目前，國內(nèi)外對滸苔低聚糖的研究較少，本文研究一種適合滸苔多糖水解成具有抗氧化性的低聚糖的制備工藝，以羥自由基清除率為指標，通過單因素試驗確定多糖酸水解適宜條件，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化水解工藝，為滸苔低聚糖的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滸苔（Enteromorpha prolifera）：市售。

纖維素酶（8×104U/g）：張家港金源生物化工有限公司；酒石酸鉀鈉、苯酚、3，5 二硝基水楊酸、正丁醇、鐵氰化鉀：分析純，南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AF-O6A 新型密封式粉碎機： 奧力中藥機械有限公司；ZNC-701 超微粉碎機： 北京興時利和發(fā)展有限公司；752N 紫外可見分光光度計： 上海奧普勒儀器有限公司；SevenEasy pH 計： 梅特勒-托利多儀器有限公司；ENCL-G-3 恒溫磁力攪拌器：上海易研實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原材料處理

滸苔→自來水洗凈→電熱鼓風干燥箱烘干4 h→密封式粉碎機粉碎→過80 目篩→超微粉碎機粉碎→滸苔粉

1.3.2 纖維素酶輔助提取多糖

滸苔粉→加水[料液比1∶15（g/mL）]→調(diào)pH 值至4.5→加入纖維素酶攪勻→45 ℃保溫6 h→加水調(diào)pH值至9→80 ℃保溫5 h→離心（4 000 r/min，15 min）→取上清液→Sevag 法脫蛋白[16]→離心→取上清液→濃縮→加無水乙醇→冷藏過夜→離心取沉淀→真空干燥→滸苔多糖聚糖水解液

1.3.3 單因素試驗

參考文獻[17]，以葡萄糖當量（dextrose equivalent，DE）值和羥自由基清除率為指標，考察料液比、溫度、時間、鹽酸濃度對滸苔多糖酸水解的影響。 試驗設(shè)計為：料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），溫度60、65、70、75、80 ℃，時間1、2、3、4、5 h，鹽酸濃度0、0.5、1、1.5、2 mol/L，每組重復(fù)3 次。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert8.0.6 軟件系統(tǒng)的Box-Behnken 中心試驗組合設(shè)計模塊，以料液比、溫度、鹽酸濃度3 個因素為自變量，羥自由基清除率為因變量，采用三因素三水平優(yōu)化滸苔抗氧化的條件，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 指標測定

1.3.5.1 多糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸法[18]測定多糖含量，吸取1 mL滸苔上清液于50 mL 容量瓶稀釋，吸取稀釋液2 mL，測定吸光度，根據(jù)樣品溶液的吸光度查標準曲線，測得含糖量，按式（1）計算。

式中：c 為從標準曲線上查得的糖濃度，mg/mL；V樣液總為上清液總體積，mL；V1為測定時取用體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)含量的測定

采用Bradford 法[16]測定多糖粗提液中蛋白質(zhì)，取3支10 mL 具塞試管，各吸取滸苔上清液0.1 mL 和蒸餾水0.9 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍G-250 蛋白試劑，充分混勻， 放置2 min 后用1 cm 比色皿在595 nm 下比色，記錄吸光值A(chǔ)595nm，以蒸餾水試管作空白，通過標準曲線查得待測樣品上清液中蛋白質(zhì)含量（μg）。

1.3.5.3 還原糖含量的測定

還原糖(以葡萄糖計)測定：參考文獻[19]的3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法進行。DE值[20]：又叫葡萄糖當量值，是還原糖（以葡萄糖計）占溶液中干物質(zhì)的百分比。 繪制標準曲線，并計算樣品中還原糖含量，按式（2）計算。

式中：c 為查標準曲線得到水解液中還原糖濃度，mg/mL；d 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，mg；v 為溶解樣品的蒸餾水體積，mL。

1.3.5.4 抗氧化活性檢測

采用水楊酸法，參照文獻[21]的方法，測定羥自由基的清除能力（scavenging activity，SA），用%表示，按式（3）計算。

式中：A0為空白對照液的吸光值；Am為加入多糖后的吸光值；An為不加H2O2時多糖的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018 軟件作圖；響應(yīng)曲面分析結(jié)果用Design-Expert 8.0 軟件進行優(yōu)化及分析；采用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以葡萄糖為標準品，蒽酮-硫酸法測得的標準曲線如圖1，回歸方程為：y=10.321x+0.007 9，R2=0.999 2。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 蛋白質(zhì)標準曲線

以牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）為標準，所得蛋白質(zhì)標準曲線如圖2， 回歸方程為y=0.008 2x+0.015 4，R2=0.998 9。

圖2 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.2 Protein standard curve

2.3 還原糖標準曲線

采用DNS 法測定還原糖量，所得還原糖標準曲線如圖3，回歸方程為y=0.582 7x-0.014 7，R2=0.999 1。 根據(jù)標準曲線得出樣品還原糖濃度，根據(jù)公式計算DE 值。

圖3 還原糖標準曲線Fig.3 Sugar standard curve

2.4 酸水解單因素試驗

2.4.1 料液比對多糖酸水解的影響

料液比對多糖酸水解的影響見圖4。

圖4 料液比對多糖酸水解的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio of acid hydrolysis of polysaccharides

如圖4 所示， 隨著溶劑體積的增加，DE 值和SA值呈現(xiàn)上升的趨勢；料液比為1∶40（g/mL）時，DE 值和SA 值達到最大，之后呈下降趨勢[10]。 故選擇料液比為1∶40（g/mL）進行下一步的響應(yīng)面試驗。

2.4.2 溫度對多糖酸水解的影響

溫度對多糖酸水解的影響見圖5。

圖5 溫度對多糖酸水解的影響Fig.5 Effect of temperature on acid hydrolysis of polysaccharides

如圖5 所示， 隨著水解溫度的升高，DE 值和SA值呈現(xiàn)上升的趨勢， 在水解溫度為70 ℃時，DE 值和SA 值達到最高； 隨著水解溫度不斷升高，DE 值和SA值呈現(xiàn)下降的趨勢。 這是由于溫度過高引起多糖的降解，溫度是反應(yīng)的重要參數(shù)，較高的反應(yīng)溫度利于反應(yīng)的進行， 但是生成低聚糖是多糖水解的中間階段，水解反應(yīng)的最終結(jié)果是生成單糖。 制備低聚糖一般需要降低溫度，使水解反應(yīng)溫和進行，盡量減少單糖的產(chǎn)生[9]。 故選擇水解溫度為70 ℃進行下一步的響應(yīng)面試驗。

2.4.3 時間對多糖酸水解的影響

時間對多糖酸水解的影響見圖6。

圖6 時間對多糖酸水解的影響Fig.6 Effect of the extract time on the acid hydrolysis of polysaccharides

如圖6 所示，隨著水解時間的延長，DE 值和SA 值呈現(xiàn)上升的趨勢；在水解時間為2 h 時，達到最高。 時間少于2 h 時，反應(yīng)不充分，DE 值和SA 值較低；但隨著水解時間不斷增加， 低聚糖在酸催化下繼續(xù)酸解為單糖，導(dǎo)致DE 值呈現(xiàn)下降的趨勢[5，10]。 方差分析表明，時間的變化對SA 值無顯著性影響。

2.4.4 鹽酸濃度對多糖酸水解的影響

鹽酸濃度對多糖酸水解的影響見圖7。

鹽酸常用于酸解制備低聚糖，易去除、易揮發(fā)、價格低廉[22]。如圖7 所示，隨著鹽酸濃度的升高，DE 值和SA 值呈現(xiàn)上升的趨勢； 在鹽酸濃度為1 mol/L 時，DE值和SA 值達到最高。 隨著鹽酸濃度不斷升高，DE 值呈現(xiàn)平緩的趨勢。 考慮到成本和環(huán)境污染的問題，故選擇鹽酸濃度為1 mol/L 進行響應(yīng)面試驗。

圖7 鹽酸濃度對多糖酸水解的影響Fig.7 Effect of concentration of hydrochloric acid to acid hydrolysis of polysaccharides

2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

2.5.1 模型方程建立與分析

通過對單因素試驗結(jié)果的方差分析，篩選出對指標有顯著影響的因素， 并確定其條件范圍。 運用Design-Expert8.0.6 軟件系統(tǒng)的Box-Behnken 模塊進行中心試驗組合設(shè)計，試驗方案設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface and results

將表2 中滸苔羥自由基清除率對自變量料液比、溫度、鹽酸濃度進行回歸擬合后，得到的回歸方程：羥自由基清除率（SA）/%=78.45-1.61A-0.59B+9.29C-28.45A2-8.54B2-11.25C2+2.54AB+1.70AC+3.46BC。 對模型進行方差分析，如表3 所示。

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果和方差結(jié)果分析Table 3 Regression coefficient significance test results and the results of analysis of variance

模型P<0.01，具有極顯著性，失擬項P=0.61，大于0.05，失擬項不顯著，表明未知因素對響應(yīng)值的影響較小，R2=0.897，表明該模型具有良好的擬合度。 對回歸模型進行分析，在該模型下自變量C 對羥自由基清除率影響顯著。 從F 值可以得出：C＞A＞B，即鹽酸濃度＞料液比＞溫度。

2.5.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面選擇的回歸模型繪制響應(yīng)面圖，見圖8。

如圖8 所示， 等高線的形狀表示兩因素之間的影響強弱，橢圓表示兩因素交互作用較強，圓則代表較弱[22]。 綜合看出，隨著溶劑量的增多，多糖酸水解后的羥自由基清除率不斷升高，但是羥自由基清除率達到最大后繼續(xù)增加溶劑的量， 羥自由基清除率會下降；隨著溫度的升高，多糖酸水解后的羥自由基清除率不斷升高，但是隨著濃度的不斷升高，羥自由基清除率會下降；隨著鹽酸濃度的不斷升高，多糖酸水解后的羥自由基清除率不斷升高， 但是隨著鹽酸濃度的不斷升高，羥自由基清除率會下降。 對回歸模型進行數(shù)學分析，得到多糖酸水解最佳條件為料液比1∶39.7（g/mL）、溫度為69.7 ℃、鹽酸濃度為1.41 mol/L，在此條件下羥自由基清除率為80.40%。

圖8 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors

2.5.3 工藝驗證

結(jié)合實際生產(chǎn)需要， 將工藝調(diào)整為料液比1∶40（g/mL）、溫度70 ℃、鹽酸濃度1.4 mol/L、時間2 h，在此條件下測出羥自由基清除率分別為78.81%、80.22%、80.27%，平均值為（79.76±0.82）%，與預(yù)測值相差很小。

3 結(jié)論

本文以滸苔為研究對象，采取纖維素酶輔助提取滸苔粗多糖，通過酸水解提取低聚糖，結(jié)果表明滸苔低聚糖具有良好的抗氧化能力。 通過回歸模型的分析，以羥自由基清除率為評價指標，經(jīng)優(yōu)化工藝為料液比1∶40（g/mL）、溫度為70 ℃、鹽酸濃度為1.4 mol/L，羥自由基清除率模型預(yù)測為80.4%，實測值為（79.76±0.82）%，說明響應(yīng)面優(yōu)化所得到的工藝可靠，具有實用價值，為滸苔資源的綜合利用提供參考。