基于病證結(jié)合探討糖尿病腎病陰虛證大鼠腎損害與自噬的關(guān)系＊

韓佳瑞，邢玉鳳，彭紫凝，商海濤，李新寶，龐欣欣，孫新宇

（1.河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腎病科 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 鄭州 450046）

糖尿病腎病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎臟疾病的常見原因[1]。DKD發(fā)病機制復雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬在DKD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2]。自噬是指細胞通過溶酶體降解大分子、細胞器、蛋白質(zhì)等，維持細胞穩(wěn)態(tài)及功能的過程。DKD發(fā)生時，各種刺激因素可導致機體內(nèi)環(huán)境紊亂，進而誘發(fā)細胞自噬水平的紊亂[3]，甚至誘導細胞死亡，進而加重DKD進展[3-5]。

中醫(yī)認為陰虛是DKD的病機關(guān)鍵，如《臨證指南醫(yī)案·三消》言 “三消一證，雖有上中下之分，其實不越陰虧陽亢，津涸熱淫而已” 。臨床上多數(shù)DKD患者可表現(xiàn)為口渴多飲、多食、潮熱盜汗、舌紅脈數(shù)、體重下降，以及血清陰虛指標值異常等陰虛證的癥候[6-8]。近年來，中醫(yī)學者以陰虛為干預靶點在DKD治療方面取得了良好效果[9]，但具體作用機制尚不完全清楚。有學者認為陰陽平衡與自噬密切相關(guān)，其中自噬被抑制能夠影響代謝產(chǎn)物或細胞成分降解，進而引起機體陰陽的盛衰、亡失，加重疾病進展[10]。有研究表明[11]，具有補陰功效的藥物能夠通過增強自噬來治療糖尿病。我們前期在河南省中醫(yī)藥拔尖人才培養(yǎng)項目專項課題的資助下，研究發(fā)現(xiàn)以養(yǎng)陰為主要治則的方劑通絡(luò)地龜湯可以通過提高足細胞自噬水平來發(fā)揮對DKD的治療作用（已錄用待發(fā)表），推測陰虛證可能與DKD中自噬抑制存在緊密的內(nèi)在聯(lián)系。

構(gòu)建合適的動物模型是探究中醫(yī)證型陰虛證與西醫(yī)疾病機制自噬關(guān)系的關(guān)鍵。病證結(jié)合動物模型指的是在中醫(yī)學證候及現(xiàn)代醫(yī)學病因的共同干預下構(gòu)建模型，使模型同時具有西醫(yī)疾病與中醫(yī)證候特征的優(yōu)勢，以便觀察中醫(yī)證侯對疾病的影響[12]。為了深入研究陰虛證和自噬在DKD疾病中的關(guān)系，本研究以病證結(jié)合理論為指導，通過腹腔注射鏈脲佐菌素建立DKD疾病模型[13]，再結(jié)合左甲狀腺素鈉水溶液灌胃法構(gòu)建DKD陰虛證病證結(jié)合模型，探討陰虛證與DKD腎損傷以及自噬功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量（150±10）g，購于河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫）2017-0001。

1.2 藥物

左甲狀腺素鈉片（優(yōu)甲樂，Merck KGaA公司，批號J20160065）；鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）購于北京索萊寶科技有限公司（批號S8050）。

1.3 主要試劑與儀器

血清肌酐（Serum creatinine，Scr）檢測試劑盒、血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）檢測試劑盒、尿蛋白定量（Urinary protein quantitation，UP）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所（批號分別為C011-2-1，C013-2-1，C035-2-1）；大鼠皮質(zhì)酮/腎上腺酮（Corticosterone，Cort）檢測試劑盒、大鼠雌二醇（Estradiol，E2）檢測試劑盒（貨號分別為CSB-E07014r，CSB-E05110r）購于武漢華美生物工程有限公司；環(huán)磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷（Cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、游離甲狀腺素4（Free Thyroxine 4，fT4）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒均購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號分別為E-EL-0056c，E-EL-0083c，E-EL-0122c）；一抗自噬相關(guān)蛋白Beclin-1抗體、P62抗體，纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）抗體、α-平滑肌肌動蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗體，羊抗兔二抗，內(nèi)參β-肌動蛋白（Beta actin，β-actin）抗體，抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（二抗工作液，即用型）均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（批號分別為11306-1-AP，18420-1-AP，15613-1-AP，14395-1-AP，SA00001-2，60008-1-lg，30201912）；一抗自噬相關(guān)蛋白LC3-II抗體購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（批號ab48394）；Trizol試劑盒購于上海荔達生物科技有限公司（批號RNAA00250）；HE染色試劑盒、糖原PAS染色液試劑盒、Masson三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司（貨號分別為G1120，G1281，G1340）；日本東京JEM-1400 PLUS型電子透射電子顯微鏡；美國伯樂公司ChemiDoc XRS+凝膠掃描成像系統(tǒng)；美國Sigma Aldrich超速低溫離心機；杭州奧盛干式恒溫器；日本SANYO超低溫冰箱；日本Nikon體視顯微鏡。

1.4 動物疾病模型的制備及分組

40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，血糖正常、尿蛋白定性實驗陰性者進入實驗。隨機選擇8只作為正常組，余32只作為模型組。采用先疾病后證型的思路造模。參照腹腔注射STZ法先建立DKD大鼠模型[13]，再根據(jù)左甲狀腺素鈉懸浮液灌胃法建立DKD大鼠陰虛證型[14]，以此構(gòu)建病證結(jié)合陰虛型DKD大鼠模型。具體方法如下：①第1步：DKD疾病造模：先建立糖尿病模型，再建立DKD模型。正常組大鼠不接受任何處理，自由飲水和進食。模型組大鼠腹腔注射STZ（55 mg·kg-1），于STZ注射72 h后，禁食不禁水12 h，尾靜脈采血測定空腹血糖，檢測血糖≥16.7 mol·L-1，即為糖尿病模型成功；于STZ注射12周后，收集大鼠24 h尿標本測定尿蛋白定量，24 h尿蛋白定量（24-hour urine protein，24 h Pro）≥30 mg，即為DKD疾病造模成功。造模過程中，模型組有4只大鼠不滿足DKD模型條件，予以剔除，最終有28只大鼠納入DKD模型組。②第2步：陰虛證型造模。將DKD模型組隨機均分為DKD組、陰虛組，每組14只，進行陰虛證模型的構(gòu)建。造模方法為陰虛組給予左甲狀腺素鈉水溶液灌胃，500μg·mL-1·kg-1，每日1次；正常組和DKD組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥4周后處死各組大鼠，分別獲取血液樣本、尿液標本及腎組織標本。經(jīng)查閱文獻[6]，擬定陰虛證造模成功標準，即大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、急躁易怒、多飲多食多尿等癥狀體征，同時滿足客觀指標血清Cort、E2、fT4、cAMP、cAMP/cGMP比值升高，cGMP值下降，提示陰虛證造模成功。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 一般狀態(tài)

觀察各組大鼠每天灌胃給藥前后的一般情況如精神、毛發(fā)、活動、二便、飲水、攝食量等。

1.5.2 血清及尿液相關(guān)指標測定

灌胃給藥第4周末，處死大鼠，經(jīng)腹主動脈采血，分離血清，測定大鼠血清cAMP、cGMP、fT4、Scr、BUN的水平。并在大鼠處死前1天收集24 h尿液，按照相關(guān)試劑盒說明步驟測定各組大鼠24 h尿蛋白含量。

1.5.3 腎組織病理學變化

大鼠處死后，迅速在無菌下摘取大鼠一側(cè)腎臟，選該側(cè)1/2腎臟置于10%甲醛固定、石蠟包埋，制成薄切片，用于HE、Masson、PAS染色檢查。

1.5.4 免疫組化檢測腎組織FN、α-SMA、Beclin-1、LC3-II、P62蛋白

將大鼠腎組織石蠟切片脫蠟，經(jīng)3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶、檸檬酸鈉修復表面抗原、山羊血清封閉，分別滴加相應(yīng)配置比例下的一抗抗體：FN（1∶100），α-SMA（1∶200）、P62（1∶100）、Beclin-1（1∶200）、LC3-II（1∶300），4℃過夜，復溫后加入二抗，于37℃孵育30 min后滴加DAB染色，顯微鏡控制下顯色，之后滴加蘇木素，逐級脫水后用樹膠封片，鏡下觀察并采圖。判斷標準：出現(xiàn)特異性棕黃色染色者為陽性，陰性對照無特異性著色。

1.5.5 電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)及自噬體形成情況

大鼠處死后，迅速在無菌下行對側(cè)腎臟穿刺，將組織置于5%戊二醛溶液中固定，透射電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)及自噬體形成情況。

1.5.6 Western Blot檢測FN、α-SMA、Beclin-1、LC3-II、P62蛋白表達

大鼠處死后，將在無菌下迅速摘取的另1/2腎臟，用生理鹽水沖洗干凈后置于液氮中待測。選取部分腎組織標本，按Western Blot操作規(guī)程進行操作，其中抗體稀釋濃度比分別為Beclin-1（1∶1000）、LC3-II（1∶1500）、P62（1∶2000）、FN（1∶6000）、α-SMA（1∶2000）、羊抗兔二抗（1∶2000）、β-actin（1∶3000），檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-II、P62及腎臟纖維化相關(guān)蛋白FN、α-SMA表達。用酶化學發(fā)光法觀察蛋白條帶，采用Image J軟件進行定量分析。

1.5.7 RT-PCR檢測FN、α-SMA、Beclin-1、LC3-II、P62轉(zhuǎn)錄水平

在樣本中加入trizol試劑提取總RNA，鑒定RNA純度和濃度，保證（260 nm處A）/（280 nm處A）均在1.8-2.0。進行cDNA反轉(zhuǎn)程序，PCR擴增FN、α-SMA、Beclin-1、LC3-II和P62基因片段。以β-actin作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系及參數(shù)依據(jù)Real-time PCR試劑盒說明書設(shè)置，反應(yīng)條件：94℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。具體引物序列為：FN上游5'-ACATA‐AAGACATACTCCACAA-3'，下 游 5'-CTTCTCCA‐CAACCCTCTGCT-3'；α-SMA 上 游 5'-GCTT‐GTCCTATAGAAGCACAAT-3'，下游5'-CGTCATTTC‐CACAGCCCTGTAT-3'；Beclin-1上 游5'-GAGAG‐GAGCCATTTATTGAAAC-3'，下 游5'-CTCCCCAAT‐CAGAGTGAAGC-3'；P62上 游5'-GGAACTGATG‐GAGTCGGATAAC-3'，下 游 5'-GTGGATGGGTC‐CACTTCTTT-3'；LC3-II上 游 5'-AGAGCGATA‐CAAGGGTGAGAAG-3'，下 游5'-AGAAGGCTTGGT‐TAGCATTGAG-3'；β-actin上 游5'-ACCCTAAGGC‐CAACCGTGAAAAG-3'，下 游5'-CATGAGGTAGTCT‐GTCAGGT-3'。

2 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

圖2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學變化（PAS染色，×400）

表2各組大鼠血清cAMP、cGMP及c AMP/c GMP表達（xˉ±s）

3.1 一般情況

在先疾病后證型的造模過程中，造模前所有大鼠精神良好，毛色光澤，行動敏捷，飲食正常。在DKD疾病造模階段，與正常組大鼠比較，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、多飲多食多尿、毛發(fā)粗糙、體質(zhì)量增加緩慢、輕度狂躁的現(xiàn)象。在陰虛證型造模階段，與DKD組大鼠相比，陰虛組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)粗糙無光澤、急躁易怒、飲食飲水量增加，同時體質(zhì)量較DKD組明顯下降的現(xiàn)象。至造模全部結(jié)束時，DKD組大鼠死亡4只，陰虛組大鼠死亡8只，最終正常組8只，DKD組10只，陰虛組6只。

3.2 各組大鼠血清及尿液樣本檢測結(jié)果

與正常組相比，各組大鼠Scr、BUN、24 h Pro水平均升高且有顯著差異性（P<0.01）；陰虛組大鼠BUN、Scr、24 h尿蛋白水平較DKD組更高且有差異性（P<0.05或P<0.01），提示陰虛組大鼠腎功能損傷較DKD組嚴重（表1-表3）。本研究選擇用血清fT4、Cort、E2、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值作為陰虛證判定標準[7]。與正常組相比，DKD組與陰虛組血清fT4、Cort、E2、cAMP、cAMP/cGMP比值明顯增加（P<0.01或P<0.05），cGMP值下降（P<0.01），提示DKD組與陰虛組存在陰虛證的表現(xiàn)。與DKD組比較，陰虛組血清fT4、Cort、E2、cAMP、cAMP/cGMP比值明顯增加（P<0.05或P<0.01），同時cGMP較DKD組降低（P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義，進一步表明陰虛組的陰虛證造模成功。

表1 各組大鼠血清Scr、BUN及24 h Pro指標（xˉ±s）

表3 各組大鼠血清Cort、fT4及E2表達（xˉ±s）

3.3 各組大鼠腎臟病理學改變

腎臟組織病理檢測是證明大鼠DKD模型造模成功的關(guān)鍵因素之一。對腎組織切片進行HE、Masson、PAS染色（圖1-圖3）。其中正常組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常均勻而清晰，無病理變化，腎臟組織正常。HE染色顯示：與正常組相比，DKD組可見腎小球基底膜增厚，腎小球萎縮；陰虛組較DKD組整體加重。PAS染色顯示：與正常組相比，DKD組腎小球基底膜增厚，腎小管基底膜有不同程度的陽性反應(yīng)，呈紫紅色；陰虛組較DKD組出現(xiàn)的PAS陽性物質(zhì)增多，紫紅色分布擴大，表明有大量糖原物質(zhì)積累。Masson染色顯示：與正常組相比，DKD組可見藍色膠原物沉積，腎小球中可見膠原纖維，腎間質(zhì)纖維化，腎小球基底膜、系膜可見紫紅色物質(zhì)沉積；與DKD組比較，陰虛組的顏色沉積更為明顯，腎間質(zhì)纖維化表現(xiàn)更重，腎小球膠原纖維增多。首先通過與正常組相比，其余組大鼠的腎臟組織皆發(fā)生了不同程度的病理損傷，這些結(jié)果表明大鼠DKD的模型構(gòu)建是成功的，其次通過比較陰虛組、DKD組腎組織的病理損傷程度，進一步提示，陰虛證加重DKD大鼠腎臟損傷。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學變化（HE染色，×400）

圖3 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學變化（Masson染色，×400）

圖5 各組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白表達（免疫組化染色，×400）

圖6 各組大鼠腎臟組織Beclin-1蛋白表達（免疫組化染色，×400）

3.4 各組大鼠腎組織FN、α-SMA、Beclin-1、LC3-II、P62蛋白免疫組化結(jié)果

為進一步探究各組大鼠的腎臟損傷情況及陰虛證與自噬的關(guān)系，對大鼠腎臟組織的纖維化蛋白、自噬相關(guān)蛋白指標進行免疫組化檢測（圖4-圖8）。纖維化蛋白α-SMA及FN、自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin-1及LC3-II陽性表達均在細胞質(zhì)，呈棕黃色。與正常組相比，DKD組、陰虛組的α-SMA及FN在腎小管與腎小球中陽性表達增加，可見大量棕黃色物質(zhì)；與DKD組相比，陰虛組腎小管、腎小球棕黃色物質(zhì)明顯增加，提示陰虛組腎組織纖維化加重。正常組中，P62在腎小管上皮細胞中少量表達，可見少量棕黃色物質(zhì)；DKD組中，P62在腎小管表達明顯增多，且腎小球呈陽性表達，皆可見到大量棕黃色物質(zhì)；與DKD組相比，陰虛組腎小管、腎小球棕黃色物質(zhì)則明顯增加，表明陰虛組P62表達增加，提示陰虛組自噬降解減弱，自噬受到抑制。與正常組相比，DKD組自噬相關(guān)蛋白LC3-II、Beclin-1在腎小球、腎小管陽性表達減少，可見少量棕黃色物質(zhì)；陰虛組較DKD組整體減弱，僅在腎小管可見陽性表達，提示陰虛組自噬抑制加重。上述結(jié)果表明，與正常組相比，其余組的腎臟纖維化加重，同時各組自噬情況也說明，在DKD情況下腎組織的自噬是被抑制的，且陰虛組自噬抑制程度更重。

圖4 各組大鼠腎臟組織FN蛋白表達（免疫組化染色，×400）

圖7 各組大鼠腎臟組織LC3-II蛋白表達（免疫組化染色，×400）

圖8 各組大鼠腎臟組織P62蛋白表達（免疫組化染色，×400）

3.5 各組大鼠電鏡下腎臟超微結(jié)構(gòu)及自噬情況

電鏡是觀察自噬的有效手段（圖9）。正常組腎小球基底膜結(jié)構(gòu)正常，足突排列有序，線粒體內(nèi)嵴明顯，自噬結(jié)構(gòu)正常；DKD組大鼠足突增寬、部分融合，腎小球基底膜增厚，線粒體內(nèi)嵴明顯，自噬結(jié)構(gòu)減少；陰虛組大鼠足突融合及基底膜增厚較DKD組更加明顯，線粒體內(nèi)嵴明顯，自噬結(jié)構(gòu)較DKD組減少。這些結(jié)果進一步說明陰虛組的自噬是被抑制的，且自噬抑制程度更深。

3.6 各組大鼠Western Blot及RT-PCR檢測結(jié)果

為進一步證實陰虛證與腎臟損傷、自噬的關(guān)系，又對各組大鼠的纖維化蛋白、自噬相關(guān)蛋白進行了Western Blot及RT-PCR檢測。

Western Blot檢測結(jié)果表明（圖10）：與正常組相比，DKD組與陰虛組的FN、α-SMA蛋白相對表達水平灰度值增加（P<0.05），提示DKD大鼠模型出現(xiàn)腎臟纖維化；其中陰虛組FN、α-SMA蛋白相對表達水平灰度值較DKD組高（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義，說明陰虛證能夠加重DKD大鼠腎臟纖維化。與正常組相比，DKD組與陰虛組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平灰度值降低（P<0.01或P<0.05），說明DKD大鼠模型自噬受到抑制；而陰虛組與DKD組比較，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平灰度值更低（P<0.05），提示陰虛證可能抑制DKD腎組織的自噬水平。DKD組P62蛋白相對表達水平灰度值顯著高于正常組（P<0.01），表明自噬體降解增強，DKD組自噬水平受抑制，與LC3-II蛋白的表達結(jié)果統(tǒng)一。而陰虛組與DKD組比較，P62蛋白的相對表達水平灰度值增加（P<0.01），提示自噬處于抑制狀態(tài)，表明陰虛證加重DKD腎臟病理損傷可能與抑制腎組織的自噬水平有關(guān)。

圖10 各組大鼠腎組織FN、α-SMA、LC3-II、Beclin-1及P62蛋白表達

RT-PCR檢測結(jié)果表明：與正常組比較，DKD組FN、α-SMA及P62 mRNA表達水平明顯升高（P<0.01或P<0.05），LC3-II及Beclin-1 mRNA表達水平明顯降低（P<0.01），表明DKD大鼠出現(xiàn)腎臟纖維化及自噬抑制（圖11）。與DKD組比較，陰虛組FN、α-SMA及P62 mRNA表達水平升高（P<0.01），LC3-II及Beclin-1 mRNA表達水平降低（P<0.05），表明陰虛組大鼠自噬抑制及腎臟纖維化加重。

圖11 各組大鼠腎組織FN、α-SMA、P62、Beclin-1及LC3-IImRNA表達結(jié)果

上述Western Blot及RT-PCR檢測結(jié)果進一步表明，陰虛證不僅能夠加重腎臟損傷，還能加重自噬抑制程度。

4 討論

中醫(yī)將糖尿病腎病歸屬于 “消渴” “水腫” 等疾病的范疇，如《圣濟總錄》提及： “消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，水液聚于體內(nèi)而出現(xiàn)水腫” 。糖尿病腎病的病機復雜難辨，多數(shù)醫(yī)家認為陰虛是其主要病機[15,16]，臨床上采用陰虛辨證治療也取得了良好的效果，但其潛在機制尚不明確。相關(guān)研究匱乏可能與動物模型的構(gòu)建有關(guān)。目前，關(guān)于中醫(yī)干預機制的基礎(chǔ)研究多通過構(gòu)建動物疾病模型進行，這些普通動物疾病模型不能較好地模擬中醫(yī)證型。近年來，病證結(jié)合動物模型的興起為解決這一難題提供了新的思路，作為一種新型的疾病模型，其不僅具有疾病與證候兼?zhèn)涞奶攸c，還可用以探索證侯對疾病的影響[17]。

本研究在病證結(jié)合理論指導下，先以腹腔注射STZ法制備DKD大鼠模型，后輔以左甲狀腺素鈉水溶液灌胃法，構(gòu)建陰虛證DKD病證結(jié)合大鼠模型，觀察陰虛證對DKD腎臟損害的影響。目前陰虛證的構(gòu)建標準尚無統(tǒng)一規(guī)定，多采用陰虛證癥候聯(lián)合客觀指標進行判定。其中陰虛癥候主要表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕或增長緩慢、五心煩熱、急躁易怒、體溫增高等，客觀指標則以內(nèi)分泌功能紊亂相關(guān)的陰虛指標為主，如腎上腺、甲狀腺、性腺等功能紊亂所致的血清Cort、fT4、E2升高，及cAMP升高、cGMP下降等[6,9,16]。在本次研究中，通過觀察各組陰虛指標可以發(fā)現(xiàn)，陰虛組大鼠血清Cort、fT4、E2、cAMP水平明顯高于DKD組，而血清cGMP下降，這與既往研究相一致。與此同時，陰虛組大鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量下降、多飲多食多尿、急躁易怒等陰虛癥候加重情況?；诖?，陰虛組大鼠呈現(xiàn)出的一般狀態(tài)及內(nèi)分泌各項指標與臨床陰虛證研究結(jié)論基本一致，進一步表明陰虛證型構(gòu)建成功。與DKD組相比，陰虛組大鼠Scr、24 h Pro及BUN升高更加明顯、腎組織糖尿病腎病的病理學改變更重，表現(xiàn)為腎臟纖維化加重、腎小球基底膜增厚、足突融合等，同時腎臟纖維化指標FN、α-SMA蛋白及其mRNA表達增高，不僅證實DKD大鼠模型構(gòu)建成功，還提示陰虛證能夠加重DKD的腎臟損傷。

自噬是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的機制之一，包括形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體、自噬體溶酶體融合、降解胞內(nèi)物質(zhì)成分3個步驟[18]。正常內(nèi)環(huán)境中，適度刺激，可通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達上調(diào)，啟動自噬泡形成，激活自噬，發(fā)揮對細胞的保護作用。LC3-II是自噬的重要標記物，參與自噬體形成，能夠反映細胞自噬功能水平，并且與自噬體數(shù)量密切相關(guān)[19]。P62蛋白為自噬酶體降解途徑的底物，兼具自噬受體蛋白與自噬選擇性底物的身份。當細胞發(fā)生自噬時，P62蛋白降解；而當自噬活性減弱或自噬功能缺陷時，P62蛋白則在細胞中累積，因此P62蛋白也能反映細胞自噬活性[20]。目前研究普遍認為[21]，在DKD的進展中，細胞自噬受到抑制。被抑制的細胞自噬通過促進凋亡等多個途徑加重DKD腎臟損傷[22]。在STZ誘導的糖尿病小鼠足細胞中，自噬相關(guān)蛋白LC3-II、Beclin-1表達明顯降低，足細胞損傷加重[23]。Wu等發(fā)現(xiàn)[24]，與正常組相比，糖尿病模型大鼠腎臟組織LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達降低，同時電鏡下，DKD大鼠腎組織自噬體減少、病理損傷加重。本研究結(jié)果顯示，DKD組及陰虛組大鼠LC3-Ⅱ、Beclin-1表達較正常組降低，且電鏡下足細胞內(nèi)自噬體數(shù)量減少，足突發(fā)生融合，腎小球基底膜變厚，這表明DKD大鼠的足細胞自噬水平被抑制，腎臟組織損傷加重，與以往研究相符。

本實驗中，與正常組相比，DKD組、陰虛組大鼠皆出現(xiàn)了不同程度的陰虛證表現(xiàn)、自噬抑制情況。且陰虛組大鼠的腎臟損傷較DKD組更為明顯。與DKD組大鼠相比，陰虛組大鼠自噬相關(guān)LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白及其mRNA表達較低，腎組織自噬相關(guān)LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的免疫組化陽性表達減弱，且電鏡下腎臟細胞內(nèi)偶見自噬體，足突明顯融合，甚至缺失，腎小球基底膜增厚，這表明陰虛證能進一步抑制腎臟自噬功能。細胞自噬是機體細胞自我清潔的重要方式，該生理過程相對于人體，與腎臟的功能相似。自噬容易受到外界因素刺激而被抑制，而腎臟同樣具有 “陰常虛” 的特點。此外，細胞自噬隨著年齡增長而減弱，這正如《素問·陰陽應(yīng)象大論》云： “年四十，而陰氣自半也，起居衰矣?！?有研究指出滋補陰方藥能增強下丘腦LC3-Ⅱ的表達[11]，增強自噬改善糖尿病認知功能障礙，證實養(yǎng)陰藥物能增強細胞自噬水平。這都提示自噬功能受損可能與中醫(yī)的陰虛證相關(guān)。

綜上所述，陰虛作為DKD的核心病機，以養(yǎng)陰為法的中醫(yī)藥治療在臨床頗為有效，然而臨床上DKD患者中醫(yī)病機復雜，較少單獨采用養(yǎng)陰藥物治療DKD，常常與其它中藥配伍使用。在DKD的眾多發(fā)病機制中，細胞自噬的紊亂占有重要地位。通過本研究發(fā)現(xiàn)，陰虛證能夠加重DKD大鼠腎臟病理損傷，進一步抑制腎臟細胞自噬標記物的表達。我們推測在DKD中陰虛證加重腎臟損傷可能與抑制腎臟組織的自噬功能有關(guān)。然而目前來看，基礎(chǔ)研究也無法做到準確的辨證論治，這也是本研究的不足之處。此外，關(guān)于陰虛證通過哪些方式調(diào)控自噬進而影響DKD進展，仍有待更深一步地研究，也為中醫(yī)藥治療DKD提供了新的研究思路。