骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠骨質(zhì)疏松股骨干骨折早期愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究

李 鵬，佘新安，趙東軍，張 勇，楊 鵬

(安康市中醫(yī)醫(yī)院骨科，陜西 安康 725000)

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是以骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、骨量減少導(dǎo)致骨折危險性增加的全身性與系統(tǒng)性骨骼疾病，多發(fā)病于女性，在臨床上可伴隨有股骨干骨折，已成為比較關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1-2]。該病的治療目的是通過提高成骨細(xì)胞成骨能力、降低破骨細(xì)胞的骨質(zhì)吸收作用影響患者骨量[3-4]。西藥治療骨質(zhì)疏松以激素為主，雖然有一定的近期療效，但是停藥后患者病情容易反復(fù)，且不良反應(yīng)比較多。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymalstem cells，BMSCs)是成骨細(xì)胞的源頭細(xì)胞，也是一種自我更新和多向分化能力的成體干細(xì)胞[5]。其具有易獲得組織修復(fù)能力、容易培養(yǎng)擴(kuò)增、低免疫原性、可移植性等特點(diǎn)，在特定條件下可以向成骨細(xì)胞分化，從而發(fā)揮成骨作用[6]。Notch基因的命名來自于一個果蠅雙翅缺口的基因突變表現(xiàn)，Notch通路具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性及功能的作用，可以通過與其他成骨信號通路交互作用發(fā)揮對機(jī)體成骨功能的抑制作用[7-8]。已有研究顯示缺失Notch 基因的突變動物胚胎成骨細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因的表達(dá)水平較正常小鼠增高，從而引起成骨細(xì)胞過度增殖[9-10]。本研究具體探討了BMSCs對骨質(zhì)疏松大鼠股骨干骨折愈合的早期影響，并分析了相關(guān)機(jī)制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 54只10周齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重為(240±20)g，購自南通特洛菲飼料科技有限公司，飼養(yǎng)于本院SPF動物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠按分籠飼養(yǎng)(每籠6只)，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，定期清除籠內(nèi)異物，動物飼養(yǎng)室溫度在22～26 ℃，濕度在45%～55%，可自由飲食、飲水和活動。各種操作嚴(yán)格按照動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施，研究得到了本院倫理委員會動物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)審批。尼爾雌醇(批號：202014222)，2%戊巴比妥鈉(批號：2020184)， 維甲酸(國藥準(zhǔn)字：H37022380)，血清堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒(上海生物工程醫(yī)藥有限公司)，抗Bcl-2抗體、抗Notch1抗體購自美國BD公司，BMSCs保存于本實(shí)驗(yàn)室，胰蛋白酶、胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。LUNAR Prodigy型雙能X線骨密度儀購自美國GE公司LUNAR Prodigy型，AG-10KN型生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)購自日本島津公司。

1.2 動物建模與分組 所有大鼠都采用維甲酸灌胃的方式制造骨質(zhì)疏松模型，用維甲酸按照70 mg/(kg·d)的劑量連續(xù)灌胃21 d，停止灌胃后繼續(xù)飼養(yǎng)30 d。股骨干、股骨頸任一部位骨密度<1.00 g/cm2表明建模成功。將建模成功的51只大鼠隨機(jī)平分為三組：模型組、尼爾雌醇組與BMSCs組。模型組給予灌胃生理鹽水，5 ml/kg，每周2次；尼爾雌醇組給予灌胃0.2 g/L的尼爾雌醇，5 ml/kg，每周2次；BMSCs組經(jīng)尾靜脈注入第三代BMMSCs約3×106個/只，1次/周。兩組都治療觀察4周。

1.3 觀察指標(biāo) ①在治療后使用眼眶采血法采集大鼠血液1 ml，1500 r/min離心10 min后收集上層上清，-80 ℃冰箱保存，采用酶法檢測血清ALP含量。②采血后處死大鼠，剔除附著于股骨的軟組織，采用雙能X線骨密度儀測定股骨干、股骨頸骨密度。③將股骨干在生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，壓力500牛頓，壓頭速度5 mm/min，記錄最大應(yīng)力(M-STRESS)、最大承載力(M-LORD)等指標(biāo)。④將右側(cè)股骨干進(jìn)行研磨，提取總蛋白，采用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)方法定量蛋白質(zhì)含量，跑SDS-PAGE電泳，每孔上樣20 μg，轉(zhuǎn)膜后3%脫脂奶封閉2 h，分別孵育Notch-1/Bcl-2和β-actin(內(nèi)參蛋白)一抗，4 ℃孵育過夜，洗滌后然后孵育二抗1 h，顯影后進(jìn)行保存分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇SPSS 23.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對本研究進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩對比用LSD-t法，多組間對比采用單因素方差分析(ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠股骨干、股骨頸骨密度比較 尼爾雌醇組與BMSCs組的股骨干、股骨頸骨密度高于模型組(均P<0.05)，BMSCs組高于尼爾雌醇組(P<0.05)，見表1。

表1 三組大鼠股骨干、股骨頸骨密度比較(g/cm2)

2.2 三組大鼠血清ALP含量比較 尼爾雌醇組與BMSCs組的血清ALP含量低于模型組，BMSCs組低于尼爾雌醇組(均P<0.05)，見表2。

表2 三組大鼠血清ALP含量比較(U/L)

2.3 三組大鼠股骨干生物力學(xué)比較 尼爾雌醇組與BMSCs組的股骨干最大應(yīng)力、最大承載力高于模型組(均P<0.05)，BMSCs組高于尼爾雌醇組(均P<0.05)，見表3。

表3 三組大鼠股骨干生物力學(xué)比較

2.4 三組大鼠股骨干Notch1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 尼爾雌醇組與BMSCs組的股骨干Notch1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平低于模型組(均P<0.05)，BMSCs組低于尼爾雌醇組(P<0.05)，見表4。

表4 三組大鼠股骨干Notch1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平比較

3 討 論

骨質(zhì)疏松是一種全身性、炎癥性骨骼疾病，很多患者受到輕微外力影響就可發(fā)生骨折，股骨干為主要的骨折部位[11]。血清中50%左右的ALP來自于骨，當(dāng)成骨細(xì)胞活躍，可見血清中ALP活性增高。測定骨密度是目前診斷骨質(zhì)疏松與預(yù)測預(yù)后的重要指標(biāo)，且具有重復(fù)性好、精確度較高等特點(diǎn)[12]。雌激素替代療法是防治和治療質(zhì)骨質(zhì)疏松的首選方案，雌激素的加入可抑制破骨細(xì)胞的形成，增加骨量減少，但長期使用雌激素類藥物有一定的不良反應(yīng)，且停藥后患者容易復(fù)發(fā)。本研究顯示尼爾雌醇組與BMSCs組的股骨干、股骨頸骨密度高于模型組(均P<0.05)，BMSCs組高于尼爾雌醇組(P<0.05)；尼爾雌醇組與BMSCs組的血清ALP含量低于模型組，BMSCs組低于尼爾雌醇組(均P<0.05)。從機(jī)制上分析，BMSCs是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在體內(nèi)受多種因素調(diào)控下分化為成骨細(xì)胞，從而參與完成骨的形成[13]。并且BMSCs具有分化能力強(qiáng)、取材簡便、來源充足等特點(diǎn)，從而有利于提高機(jī)體的血清ALP含量與骨密度[14-15]。

解決骨質(zhì)疏松患者骨損傷愈合延遲的關(guān)鍵在于提高患者的成骨作用，BMSCs轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞途徑是骨骼修復(fù)時成骨作用的重要來源[16]。骨生物力學(xué)為反映骨組織在外界作用下力學(xué)特征和骨在受力后的生物學(xué)效應(yīng)，反映了整體骨的抗骨折能力，其中應(yīng)力是指骨抵抗外力而不產(chǎn)生變形的能力，承載力是指骨抵抗外力破壞的能力[17-18]。本研究顯示尼爾雌醇組與BMSCs組的股骨干最大應(yīng)力、最大承載力高于模型組(均P<0.05)，BMSCs組高于尼爾雌醇組(P<0.05)。從機(jī)制上分析，BMSCs可促進(jìn)骨痂的形成，加快骨損傷的愈合過程。有研究表明，BMSCs能打破破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的平衡，從而提高骨組織細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，從而促進(jìn)該區(qū)域的骨形成[19]。

Notch信號通路參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，Notch-1是Notch受體的重要類型。Notch信號通路隨后被激活，Notch-1表達(dá)增加，可進(jìn)而激活下游靶基因[20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)股骨干骨缺損小鼠模型行中Notch1表達(dá)量顯著上升，特別是在Notch過表達(dá)的小鼠成骨細(xì)胞中，ALP活性顯著降低[21]。Bcl-2也是成骨信號通絡(luò)的關(guān)鍵因子，能夠調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和活化[22]。本研究顯示尼爾雌醇組與BMSCs組的股骨干Notch1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平低于模型組(均P<0.05)，BMSCs組低于尼爾雌醇組(P<0.05)，表明BMSCs能抑制大鼠Notch1、Bcl-2蛋白的表達(dá)。當(dāng)前也有研究顯示BMSCs具有抑制破細(xì)胞活性，促使鈣化骨形成增加等多種作用，可導(dǎo)致骨形成大于骨吸收，從而抑制繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的發(fā)生[23-25]。本研究也存在一定的不足，通過骨密度值與生物力學(xué)測定很難全面反映股骨干骨折的早期愈合情況，可能存在誤差，同時通過注射治療難以保證BMSCs數(shù)量完全一致，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。

總之，BMSCs在骨質(zhì)疏松大鼠股骨干骨折中的應(yīng)用能促進(jìn)早期愈合，可抑制Notch1、Bcl-2表達(dá)，有利于降低血清ALP水平與提高骨密度，改善股骨干的生物力學(xué)狀況。