中國(guó)南方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群遺傳結(jié)構(gòu)及Wolbachia感染

李 菁, 張小飛, 徐玲玲, 申圓圓, 李肖肖, 王振營(yíng)

(1. 西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院, 西安 710065; 2. 西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心, 西安 710061;3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193)

雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲Monoleptahieroglyphica,亦稱雙斑螢葉甲，屬鞘翅目(Coleoptera)葉甲科(Chrysomelidae)螢葉甲亞科(Galerucinae)，是一種在我國(guó)分布范圍極廣的多食性害蟲(chóng)，除取食玉米、高粱、棉花、向日葵、豆類等多種作物外，還取食多種林木和雜草，且能在不同寄主植物之間轉(zhuǎn)移為害(陳靜等, 2007; 張聰, 2012; 劉景皓, 2018)。該害蟲(chóng)對(duì)玉米等多種農(nóng)作物的為害近年來(lái)呈現(xiàn)加重趨勢(shì)，為害區(qū)域和面積逐年擴(kuò)張，已成為多地區(qū)玉米等作物上的重要害蟲(chóng)之一(Zhengetal., 2020)。

遺傳多樣性豐富、遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜的昆蟲(chóng)種群往往更能適應(yīng)生存環(huán)境的變化，在化學(xué)藥劑的連續(xù)篩選下也更易演化出抗藥性(Xinetal., 2014)。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中要對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行有效防治，應(yīng)先對(duì)其田間種群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)查和評(píng)估。目前DNA測(cè)序中最常用的就是線粒體DNA(mtDNA)，由于在演化過(guò)程中昆蟲(chóng)的線粒體基因具有選擇壓力小，突變易穩(wěn)定遺傳，在群體中變異率較高等特點(diǎn)，常被用作系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化研究的分子標(biāo)記(Lynchetal., 2006; Nabholzetal., 2008; 李菁等, 2018b)。在線粒體基因中，細(xì)胞色素氧化酶COI和COII基因具有較豐富的變異，在種下階元系統(tǒng)發(fā)育及遺傳結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用尤為廣泛(Liu and Beckenbach, 1992)。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲及其近緣種屬的種群遺傳學(xué)研究較少，分子系統(tǒng)學(xué)研究多集中在目、科、亞科和屬的水平上，包括亞科內(nèi)不同族或?qū)僦g的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與螢葉甲部分屬種與寄主植物間的進(jìn)化關(guān)系等(Huntetal., 2007; 陳光輝等, 2016)。通過(guò)葉甲科中跳甲亞科、螢葉甲亞科和葉甲亞科共11屬15種昆蟲(chóng)間的系統(tǒng)進(jìn)化分析，不同屬均表現(xiàn)為明顯的單系性，證明COII基因是分析葉甲亞科及種屬階元分類與進(jìn)化的有效分子標(biāo)記(張高峰, 2006)。而在種內(nèi)種群水平上，中國(guó)北方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲不同地理種群之間已產(chǎn)生明顯的遺傳分化，不同種群間基因流水平低，且推測(cè)在近期未出現(xiàn)種群擴(kuò)張現(xiàn)象(梁日霞等, 2011)。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲在中國(guó)的分布遍及南北方多省區(qū)，然而迄今國(guó)內(nèi)外對(duì)該甲蟲(chóng)的種群遺傳學(xué)研究?jī)H限于中國(guó)北方種群(梁日霞等, 2011)。

本研究以線粒體COII基因作為分子標(biāo)記，對(duì)中國(guó)南方地區(qū)的雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性進(jìn)行研究，作為該害蟲(chóng)南方種群研究數(shù)據(jù)的補(bǔ)充，并與先前報(bào)道的北方種群進(jìn)行比較分析，同時(shí)對(duì)南方種群中共生菌Wolbachia進(jìn)行感染率檢測(cè)和感染類群分析，從種群遺傳學(xué)水平上探討該害蟲(chóng)能適應(yīng)多種寄主植物和氣候環(huán)境的內(nèi)在遺傳因素，為日后對(duì)其制定科學(xué)有效的防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

本研究供試的雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲14個(gè)地理種群于2016-2018年間采集自中國(guó)南方9個(gè)省區(qū)(其中，包括陜西南部的兩個(gè)種群)，采集地均為玉米田。每個(gè)種群采集不少于25頭(為便于田間識(shí)別，采集蟲(chóng)態(tài)均為成蟲(chóng))。采回后單頭成蟲(chóng)置于離心管中，于-20℃凍存。各種群采樣信息詳見(jiàn)表1。

表1 供試中國(guó)南方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群樣本采集信息

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

單頭雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲在1×TE緩沖液(Tris-EDTA，pH 8.0)中冰浴勻漿，應(yīng)用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(型號(hào)DP304，TIANGEN)提取供試甲蟲(chóng)基因組DNA。提取完畢后通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量，并利用NanoDrop微量核酸/蛋白測(cè)定儀(Thermo)測(cè)定提取DNA的濃度及純度，檢測(cè)合格后保存于-20℃冰箱備用。

雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲COII基因擴(kuò)增特異性引物序列參考梁日霞等(2011)，PCR反應(yīng)體系(20 μL): 2×Taq PCR MasterMix 10 μL(TIANGEN)，正/反向引物(10 mmol/L)各1 μL, 模板DNA 1 μL, ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 3 min; 95℃30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后每個(gè)樣品各取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(1.5%瓊脂糖凝膠)，確認(rèn)擴(kuò)增出預(yù)期大小的單一片段后，將剩余PCR產(chǎn)物送交生工生物工程有限公司進(jìn)行純化及雙向測(cè)序。

1.3 Wolbachia感染率檢測(cè)

通過(guò)PCR擴(kuò)增Wolbachia的wsp基因?qū)┰囯p斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群進(jìn)行Wolbachia感染率檢測(cè)，以實(shí)驗(yàn)室中確定感染W(wǎng)olbachia的亞洲玉米螟DNA樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以ddH2O作為陰性對(duì)照。檢測(cè)所用引物為wsp81F(5′-TGGTCCAATAAGTGATGAA GAAAC-3′)和wsp691R(5′-AAAAATTAAACGCTA CTCCA-3′)，供試引物由生工生物工程有限公司合成。在每個(gè)種群的感染個(gè)體中隨機(jī)選取10頭進(jìn)行wsp基因片段PCR擴(kuò)增和亞克隆，PCR體系、PCR反應(yīng)程序及亞克隆具體方法參見(jiàn)李菁等(2018a)。委托生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，計(jì)算Wolbachia在各供試雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群中的感染率(%)。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過(guò)Chromas軟件讀取1.2節(jié)測(cè)序數(shù)據(jù)，并將正反向序列拼接后在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST比對(duì)，確認(rèn)為雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲COII基因再經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行多序列同源比對(duì)，為便于與已發(fā)表的中國(guó)北方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群COII基因數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析(梁日霞等, 2011)，最終所有供試個(gè)體的COII基因測(cè)序樣本均統(tǒng)一截取484 bp序列長(zhǎng)度進(jìn)行后續(xù)分析。應(yīng)用DnaSP6軟件(Rozasetal., 2017)計(jì)算單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)、種群間遺傳分化指數(shù)(Fst)和基因流(Nm)等，并進(jìn)行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)。結(jié)合雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲中國(guó)北方種群的COII數(shù)據(jù)結(jié)果(梁日霞等, 2011)，應(yīng)用Network10.1軟件基于median-joining算法構(gòu)建單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖，并基于鄰接法中的Kimura 2-parameter模型應(yīng)用MEGA6軟件(Tamuraetal., 2013)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)各分支進(jìn)行1 000次置信度重復(fù)檢驗(yàn)。應(yīng)用Arlequin v3.5軟件(Excoffier and Lischer, 2010)進(jìn)行種群變異的分子方差分析(AMOVA)。通過(guò)Genepop在線工具(http:∥www.genepop.curtin.edu.au/genepop_op6.html)，對(duì)種群間地理距離與遺傳距離進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。分析Wolbachia感染類群及株系，在PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中選取具有代表性的Wolbachia株系，與本研究中所測(cè)得雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群中感染W(wǎng)olbachia的wsp基因序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(最大似然法)，建樹(shù)時(shí)采用MEGA6軟件中的Kimura2-parameter模型，檢驗(yàn)支持率Bootstrap設(shè)置為1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 COII基因變異位點(diǎn)及單倍型

對(duì)供試14個(gè)地理種群共403頭雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲個(gè)體COII基因片段序列進(jìn)行整理和多重比對(duì)，將兩端存在測(cè)序誤差的區(qū)段截去，并參考梁日霞等(2011)在GenBank中登錄的中國(guó)北方種群COII基因單倍型序列，最終在所有供試個(gè)體中均截取484 bp長(zhǎng)度序列片段，該COII基因片段中共發(fā)現(xiàn)27個(gè)變異位點(diǎn)，約占分析區(qū)段位點(diǎn)總數(shù)的5.6%，并包含2個(gè)單變異位點(diǎn)(singleton variable sites)和25個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites)。在測(cè)序序列中不存在堿基插入/缺失現(xiàn)象，并表現(xiàn)出昆蟲(chóng)線粒體基因A/T堿基偏倚性的特點(diǎn)(A+T平均含量占76.0%)。

本研究在供試14個(gè)地理種群中總共發(fā)現(xiàn)23種單倍型，將23種COII單倍型序列分別在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線BLAST，發(fā)現(xiàn)其中有10種單倍型與梁日霞等(2011)登錄的單倍型序列完全一致，分別命名為MHap14-MHap23(GenBank登錄號(hào)分別為HQ909339, HQ909343, HQ909353, HQ909346, HQ909340, HQ909342, HQ909348, HQ909349, HQ909347及HQ909341)。為避免造成數(shù)據(jù)庫(kù)冗余重復(fù)信息，將新發(fā)現(xiàn)的13種單倍型命名為MHap1-MHap13(GenBank登錄號(hào): MT861137-MT861149)；沒(méi)有全部種群均有共享的單倍型，至少在2個(gè)種群中出現(xiàn)的單倍型有11種，而有12種單倍型僅在1個(gè)種群中出現(xiàn)(表2)。

2.2 種群遺傳多樣性及中性檢驗(yàn)

供試14個(gè)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群的總種群Hd為0.748，Pi為0.00769，核苷酸平均差異數(shù)(K)為3.7232。各種群包含的單倍型數(shù)(h)在2～6之間，變異位點(diǎn)數(shù)(S)在2～20之間，Hd在0.394～0.782，Pi在0.00125～0.01512(表2)?？偡N群的Tajima’sD和Fu’sFs檢驗(yàn)均為負(fù)值且不顯著，在不同種群中這兩項(xiàng)中性檢驗(yàn)值既有正值也有負(fù)值，且只有NS種群的Tajima’sD檢驗(yàn)結(jié)果為顯著正值(D值為2.0704，P<0.05)(表2)。

表2 基于中國(guó)南方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群COII基因序列的遺傳多樣性及中性檢驗(yàn)

2.3 COII單倍型系統(tǒng)進(jìn)化

雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲中國(guó)北方種群數(shù)據(jù)(梁日霞等, 2011)與本研究中中國(guó)南方種群的數(shù)據(jù)相結(jié)合，構(gòu)建COII單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)。在28種單倍型中，有13種單倍型(MHap1～MHap13)為南方種群所獨(dú)有且個(gè)體總和數(shù)量較大，有5種單倍型為北方種群獨(dú)有且個(gè)體總和數(shù)量較小，有10種單倍型(MHap14～MHap23)為南、北方種群所共有。在所有供試個(gè)體中出現(xiàn)頻率最高的3種單倍型依次為MHap14, MHap1和MHap3，其中在Hap14單倍型的組成個(gè)體中采自北方種群的個(gè)體數(shù)占比70.9%，南方種群的個(gè)體數(shù)占比29.1%。除上述3種單倍型外， MHap17, MHap15和MHap19也是出現(xiàn)頻率較高的單倍型種類，且這3種單倍型在南方和北方種群中均存在，所占數(shù)量比例不同。整個(gè)單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可分成兩個(gè)部分：主干部分以MHap14為中心，有21種單倍型圍繞其呈輻射狀分布，共占全部個(gè)體數(shù)(含南方種群和北方種群)的96.1%；另一部分距離主干較遠(yuǎn)(圖1中方框內(nèi)所示)，由7種單倍型組成且在種群中分布頻率很低，僅占到全部個(gè)體數(shù)的3.9%。兩部分內(nèi)部的單倍型彼此間變異位點(diǎn)數(shù)較少，而兩部分單倍型之間的變異位點(diǎn)數(shù)較多。由COII單倍型序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分支結(jié)構(gòu)來(lái)看(圖2)，在南方種群和北方種群中共檢測(cè)到的28種單倍型聚為兩大分支，第一大支共包含21種單倍型，所包括的單倍型涵蓋全部供試種群，其中南方種群和北方種群所共有的MHap15和MHap19兩種單倍型又與其他15種單倍型獨(dú)立分成一個(gè)分支；第二大支共包含7種單倍型，其中有4種單倍型為南方種群特有，分布于5個(gè)南方種群的少數(shù)個(gè)體中，另有1種單倍型(HQ909352)僅在北方的1個(gè)種群中出現(xiàn)(梁日霞等, 2011)。由單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所展現(xiàn)的親緣關(guān)系可以看出，總體而言南方種群的單倍型多樣性更高且在種群中的分布更加分散，而北方種群的單倍型多樣性較低且在種群中的分布相對(duì)集中。

圖1 中國(guó)南方和北方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群COII基因單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于COII基因序列的中國(guó)南方和北方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群?jiǎn)伪缎拖到y(tǒng)發(fā)生樹(shù)(1 000次重復(fù))

2.4 種群遺傳分化與基因流

14個(gè)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群間總體Fst為0.2481，總體Nm為0.76，說(shuō)明種群間遺傳分化程度普遍較高，種群間基因流弱。從各種群間這兩項(xiàng)參數(shù)來(lái)看，種群間遺傳分化指數(shù)Fst數(shù)值在0.0102～0.8239之間，其中有11對(duì)種群間無(wú)明顯的遺傳分化(Fst<0.05)，占比12.09%；30對(duì)種群間存在中等水平的遺傳分化(0.050.25)，占比34.07%。Fst最低和最高值分別出現(xiàn)在YA-NS(四川雅安-湖北恩施)和DH-AK(云南德宏-陜西安康)種群間(表3)。 各種群間基因流Nm數(shù)值在0.0534～24.2598之間，其最大基因流和最小基因流值也相應(yīng)出現(xiàn)在YA-NS和DH-AK種群間。上述結(jié)果表明，超過(guò)半數(shù)的雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群間存在較高或高水平的遺傳分化，種群間基因交流較低。

表3 基于COII基因序列的中國(guó)南方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群間遺傳分化指數(shù)(Fst)(下三角)與基因流(Nm)(上三角)

AMOVA結(jié)果顯示COII基因遺傳變異種群間方差組分為0.4978，所占方差比率為26.25%；種群內(nèi)方差組分為1.3986，所占方差比率為73.75%，二者均為極顯著水平(表4)，表明雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群的遺傳分化主要來(lái)自種群內(nèi)部個(gè)體間的變異，其次才是來(lái)自種群間的分化。

表4 基于COII基因序列的中國(guó)南方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群變異分子方差分析

為了檢測(cè)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲不同地理種群之間的遺傳分化程度是否與地理隔離相關(guān)，對(duì)兩兩種群間的遺傳距離與地理距離(取自然對(duì)數(shù))之間的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，得到遺傳距離與地理距離之間的線性回歸方程為y=0.103x-0.435，相關(guān)系數(shù)R為0.2898(P=0.0640>0.05，1 000次隨機(jī)抽樣)，表明雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群間的遺傳分化與地理隔離之間無(wú)顯著相關(guān)性(圖3)。

圖3 中國(guó)南方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群間遺傳距離與地理距離對(duì)數(shù)相關(guān)性分析

2.5 Wolbachia感染率及感染類型

對(duì)14個(gè)地理種群403頭雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲個(gè)體進(jìn)行Wolbachia共生菌感染檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有396頭感染，各種群內(nèi)感染率在92.59%～100%之間不等，平均感染率為97.60%，其中有7個(gè)種群感染率高達(dá)100%(表5)。可見(jiàn)Wolbachia在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲內(nèi)的感染相當(dāng)普遍，在種群中均具有很高的感染率。

wsp基因序列分析發(fā)現(xiàn)供試雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群中共感染了6種Wolbachia株系(strain)，根據(jù)通用命名法則將其命名為wMhie1～wMhie6，6個(gè)株系克隆獲得的wsp片段序列長(zhǎng)度分別為624, 621, 651, 606, 594和636 bp(GenBank登錄號(hào): JF747223-JF747228)，wsp基因遺傳相似度在78%～93%之間，遺傳距離在0.025～0.150之間(表6)。在感染株系中，wMhie1株系在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群中的感染率最高，占檢測(cè)個(gè)體的62.86%；其次是wMhie2，占檢測(cè)個(gè)體的26.43%；其他4種株系在種群中的感染率均較低，wMhie3僅在5個(gè)種群中檢測(cè)到(占檢測(cè)個(gè)體的5.00%)，wMhie4和wMhie5僅在3個(gè)種群中檢測(cè)到，而wMhie6僅在2個(gè)種群中檢測(cè)到(表5)。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲中感染的6種Wolbachia株系(即wMhie1～wMhie6)全部屬于A大組，但在系統(tǒng)聚類上與A組中已知的代表性株系分開(kāi)而單獨(dú)聚為一個(gè)分支，在這個(gè)分支內(nèi)部又表現(xiàn)為wMhie4與wMhie6聚為一支，另外4個(gè)株系聚為另一支，且wMhie株系聚類分支結(jié)構(gòu)的置信度分值均高于90，可見(jiàn)此聚類結(jié)果具有較高可信度(圖4)?；谝陨辖Y(jié)果，認(rèn)為雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲中感染的6種株系均屬于不同于其他昆蟲(chóng)物種中感染的Wolbachia類群。

圖4 鄰接法構(gòu)建的基于wsp序列的Wolbachia系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1 000次重復(fù))

3 討論

本研究以線粒體COII基因作為分子標(biāo)記，對(duì)中國(guó)南方多省區(qū)分布的雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及種群間遺傳分化程度進(jìn)行了綜合分析。在先前報(bào)道的北方種群數(shù)據(jù)結(jié)果基礎(chǔ)上，又檢測(cè)到13種新的COII基因單倍型。與梁日霞等(2011)報(bào)道的北方種群相比，無(wú)論是總?cè)后w還是各種群間的平均值，南方種群在單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣度和核苷酸平均差異數(shù)等幾項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)上均明顯高于北方種群，說(shuō)明雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲南方種群的遺傳多樣性普遍高于北方種群，即南方種群具有更豐富的遺傳多樣性。造成南北方種群遺傳多樣性存在差異的原因可能與環(huán)境溫度相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲的發(fā)育歷期與溫度顯著相關(guān)，其卵、幼蟲(chóng)和蛹的發(fā)育速率隨溫度升高而加快(李廣偉等, 2010; 張聰, 2012)。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲在我國(guó)北方為一年發(fā)生1代，以卵在土壤中越冬(張聰?shù)? 2013, 2014)，而其在我國(guó)南方地區(qū)的發(fā)生代數(shù)迄今尚未有研究報(bào)道，推測(cè)該種昆蟲(chóng)與鞘翅目其他甲蟲(chóng)相似，即隨緯度降低年發(fā)生代數(shù)增加，因此較發(fā)生代數(shù)少、發(fā)育歷期長(zhǎng)的北方種群，南方種群內(nèi)部發(fā)生遺傳變異的幾率增加，種群內(nèi)具有更豐富的遺傳多樣性。

遺傳分化指數(shù)Fst可反映出種群間的遺傳分化程度，通常Fst值越大說(shuō)明群體間遺傳分化程度越高。普遍認(rèn)為當(dāng)Fst<0.05時(shí)群體間遺傳分化程度很低，當(dāng)0.050.25時(shí)群體間遺傳分化程度很高(Rousset, 1997)。本研究中雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲總種群Fst為0.2481(表3)，且有超過(guò)50%的種群間存在較高或高水平的遺傳分化。通常當(dāng)Nm>4時(shí)，表示種群間基因交流的勻質(zhì)化作用足以削減因遺傳漂變導(dǎo)致的遺傳分化(Whitlock and McCauley, 1999)，本研究中供試總種群基因流Nm為0.76，且有83.52%的種群間Nm值均小于4，說(shuō)明供試雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群間基因交流弱，同時(shí)與種群間遺傳分化程度高的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。先前的研究結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn)，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲北方種群間遺傳分化程度高且基因交流不頻繁(梁日霞等, 2011)，由此可見(jiàn)不論南方種群還是北方種群該螢葉甲種群間普遍存在較高程度的遺傳分化。由于雙斑長(zhǎng)跗螢葉成蟲(chóng)飛行能力較弱，一般只能進(jìn)行2～5 m近距離飛行，因此種群內(nèi)部個(gè)體只能進(jìn)行局部擴(kuò)散而不能進(jìn)行遠(yuǎn)距離遷移(杜建軍和云雷, 2009; 陳光輝等, 2016)，我國(guó)地形復(fù)雜，連綿山脈或沙漠的阻隔，加之其寄主植物種植區(qū)在地理距離上的間斷，致使多數(shù)種群間無(wú)法通過(guò)連續(xù)擴(kuò)散而達(dá)到廣泛基因交流的結(jié)果，可能是導(dǎo)致種群間普遍存在明顯遺傳分化的主要原因。

對(duì)比雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲北方種群的數(shù)據(jù)，本研究在南方種群中檢測(cè)到更加豐富的線粒體基因單倍型，從單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的結(jié)構(gòu)(圖2)來(lái)看，MHap14, MHap1和MHap3這3種單倍型在種群中出現(xiàn)頻率最高，且均位于單倍型的主干分支中，說(shuō)明這3種單倍型作為該昆蟲(chóng)種群中的優(yōu)勢(shì)單倍型在群體中較穩(wěn)定的遺傳下來(lái)。而有7種單倍型構(gòu)成了一個(gè)與主干分支距離較遠(yuǎn)的叢支，其中的單倍型與多數(shù)單倍型之間存在較多的變異位點(diǎn)。這些稀有單倍型的存在豐富了種群的遺傳多樣性，在一定程度上體現(xiàn)了昆蟲(chóng)種群具備應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的進(jìn)化潛力。在主干單倍型與稀有單倍型之間尚存在若干“過(guò)渡”單倍型在供試個(gè)體中未檢測(cè)到，可能這些缺失的單倍型(變異位點(diǎn))由于存在個(gè)體稀少已逐漸被淘汰或由于采樣量的限制未被檢測(cè)到。

本研究供試雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群中性檢驗(yàn)結(jié)果大多為負(fù)值且不顯著(表2)，因此不支持種群數(shù)量消減或增長(zhǎng)、經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)或發(fā)生大規(guī)模遷移事件的假設(shè)，在進(jìn)化上遵循中性模型，表明種群在較近的歷史時(shí)期內(nèi)沒(méi)有經(jīng)歷明顯的群體擴(kuò)張事件，種群大小保持相對(duì)穩(wěn)定(Korneliussenetal., 2013)，此推論與北方種群的檢驗(yàn)結(jié)果(梁日霞等, 2011)一致。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲為多食性昆蟲(chóng)，寄主植物種類豐富，因此能應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化而保持種群的穩(wěn)定，另外該種昆蟲(chóng)飛行能力弱，在一定程度上制約了種群的遷移和擴(kuò)張，這也是維持種群相對(duì)穩(wěn)定的另一個(gè)原因。

有研究提出Wolbachia在宿主中的感染率常遵循“或多或少(most or few)模式”，即一個(gè)物種內(nèi)的Wolbachia感染率通常會(huì)很高(>90%)或很低(<10%)(Hilgenboeckeretal., 2008)。對(duì)葉甲科昆蟲(chóng)Wolbachia感染已有一些研究，Ali等(2018)通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)椰心葉甲Brontispalongissima5個(gè)東南亞種群中Wolbachia感染率高達(dá)100%，且感染類群十分豐富。本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)南方雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲所有供試種群中的Wolbachia感染率均高于90%，其中有一半種群100%感染，整體平均感染率高達(dá)97.60%(表5)，證明Wolbachia在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲宿主中的感染率符合上述規(guī)律。通過(guò)wsp基因序列共檢測(cè)到6種Wolbachia株系，表明在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲宿主中感染著豐富的Wolbachia類群。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲中感染的6種株系均與目前已知感染昆蟲(chóng)的代表性株系在系統(tǒng)進(jìn)化上關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)，尚無(wú)法在系統(tǒng)發(fā)生上對(duì)其準(zhǔn)確劃分類群，且這6種Wolbachia株系是否具有對(duì)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲宿主具有生殖調(diào)控作用仍然未知。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，Wolbachia對(duì)其昆蟲(chóng)宿主的調(diào)控作用可能在宿主種群發(fā)生遺傳分化過(guò)程中起到了重要的作用，其中一個(gè)潛在機(jī)制是Wolbachia誘導(dǎo)的胞質(zhì)不親和能夠有效阻礙感染不同株系的宿主種群之間進(jìn)行基因交流，從而加速了宿主種群間的遺傳分化，甚至可能促進(jìn)新物種的形成(J?ckeletal., 2013; Zhangetal., 2013; Lisetal., 2015)。本研究發(fā)現(xiàn)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群間普遍存在遺傳分化且基因交流不頻繁，這種現(xiàn)象是否與Wolbachia的生殖調(diào)控作用相關(guān)仍是未來(lái)研究中需要解答的一個(gè)問(wèn)題。在今后的研究中，還需要通過(guò)MLST(多位點(diǎn)序列分型)系統(tǒng)對(duì)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲中感染的Wolbachia類群進(jìn)行更加系統(tǒng)的鑒定，并將Wolbachia感染類群與宿主線粒體單倍型進(jìn)行結(jié)合分析，進(jìn)一步探究Wolbachia感染是否在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲種群間產(chǎn)生遺傳分化過(guò)程中發(fā)揮了作用。