彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代倍性鑒定及染色體核型分析

張慶飛，郭青松，虞炯瑩，操文杰，王衛(wèi)民

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.武漢市江夏區(qū)農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，武漢 430200)

彭澤鯽(Carassiusauratusvar.pengsenensis)產(chǎn)于江西省九江市彭澤縣，屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯽屬(Carassius)，具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗病性及抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，是淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。彭澤鯽最初被認(rèn)為是正常的二倍體(2n=166)，營(yíng)兩性生殖[1]，現(xiàn)已公認(rèn)彭澤鯽為三倍體(3n=150+)魚(yú)類，且生殖方式為兩性型雌核發(fā)育[2]。興國(guó)紅鯉(Cyprinuscarpiouvar.singuonensis)產(chǎn)于江西省興國(guó)縣，屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯉屬(Cyprinus)，其背寬肉厚、肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)快、食性廣且抗逆性強(qiáng)，同時(shí)興國(guó)紅鯉雜交親和力強(qiáng)，是重要的雜交親本。

天然雌核發(fā)育的魚(yú)類通常為三倍體或四倍體[3]，在發(fā)育過(guò)程中精子只刺激卵子發(fā)育，本身并不融合，后代的生物學(xué)特性幾乎與母本相同而不具有父本的遺傳性狀。目前已有研究表明，利用異精刺激天然雌核發(fā)育魚(yú)類可產(chǎn)生正常的子代，但是不同種類的雄性精子產(chǎn)生的誘導(dǎo)效果差異顯著。本實(shí)驗(yàn)室在興國(guó)紅鯉雄魚(yú)精子刺激彭澤鯽雌核發(fā)育的子代中發(fā)現(xiàn)了四倍體，并于2020年5月進(jìn)行擴(kuò)繁得到子二代，推測(cè)該四倍體發(fā)生了兩性融合，產(chǎn)生了遠(yuǎn)緣雜交四倍體。遠(yuǎn)緣雜交魚(yú)類通常結(jié)合雙親的優(yōu)勢(shì)性狀，具有較高的育種潛力，但能否穩(wěn)定遺傳仍存疑問(wèn)。染色體作為遺傳信息的載體，可以直觀地了解其遺傳變化和遺傳特征，進(jìn)一步判斷子代的親緣關(guān)系，因而對(duì)其子代進(jìn)行倍性鑒定及染色體核型分析極為重要。

本研究通過(guò)對(duì)彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代進(jìn)行倍性鑒定和染色體核型分析，旨在為遠(yuǎn)緣雜交多倍體育種提供理論依據(jù)，探討新品種的應(yīng)用前景，同時(shí)也為原位雜交等研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

彭澤鯽親本來(lái)源于江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)南湖水產(chǎn)養(yǎng)殖基地進(jìn)行產(chǎn)前培育，并在2020年5月挑選性腺成熟且健康無(wú)病的親本進(jìn)行人工繁殖得到子代；實(shí)驗(yàn)室前期在興國(guó)紅鯉精子刺激彭澤鯽卵子雌核發(fā)育的子代中發(fā)現(xiàn)四倍體，并于2020年5月挑選性腺成熟且健康無(wú)病的親本進(jìn)行繁殖得到健康子代。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血液采集

用EDTA抗凝劑浸潤(rùn)一次性注射器內(nèi)壁，采用尾靜脈抽血的方式，從魚(yú)體側(cè)線下方扎針，碰到脊柱時(shí)向后輕拉針頭，抽血1 mL置于2 mL離心管中，4 ℃保存，用于測(cè)定DNA相對(duì)含量，未加抗凝劑的血液直接用于血涂片的制備。

1.2.2 DNA相對(duì)含量測(cè)定

選用三倍體彭澤鯽血細(xì)胞作為內(nèi)參，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)倍性。取抗凝血?jiǎng)?0 μL置于2 mL離心管中，加入500 μL DAPI染液，再加入500 μL PBS緩沖液，用300目濾膜過(guò)濾，避光染色5 min后，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 血涂片制備

取一滴未加抗凝劑血液滴在光滑平整的載玻片上，將載玻片緩慢靠近血液，待血液散開(kāi)后，以30°～40°的角度勻速向前推片形成血膜，待血膜完全晾干后進(jìn)行染色。將Giemsa母液用PBS緩沖液稀釋10倍后配置成工作液，滴加Giemsa染液染色1 min，再滴加等量的PBS緩沖液，染色30 min。30 min后流水沖洗，室溫干燥。每種魚(yú)制作10張血涂片，在Olympus正置顯微鏡下觀察拍照，每張血涂片測(cè)量20個(gè)紅細(xì)胞的長(zhǎng)軸a和短軸b，根據(jù)公式表面積S=πab/4、體積V=a2b/1.91計(jì)算紅細(xì)胞和細(xì)胞核的表面積與體積。

1.2.4 組織塊原代細(xì)胞培養(yǎng)

取兩種子代幼魚(yú)并用75%酒精消毒體表，剪取鰭條及肌肉置于盛有AIM的培養(yǎng)皿中浸泡2 h，每半小時(shí)更換AIM，期間切除刮去多余組織。將組織塊切碎成1 mm2小塊均勻鋪散在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用移液管從細(xì)胞培養(yǎng)瓶側(cè)面緩慢加入4～5 mL原代培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置6～8 h，翻轉(zhuǎn)后靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，可消化傳代，原瓶可保留繼續(xù)生長(zhǎng)細(xì)胞。

1.2.5 染色體標(biāo)本制備

參考祝冬梅[4]染色體標(biāo)本制備方法，取鋪滿細(xì)胞的細(xì)胞瓶，加入秋水仙素至終濃度為1.5 μg/mL，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱處理3 h。吸出秋水仙素，用0.25%胰酶消化，再加入等量原代培養(yǎng)基，中止消化。將細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)入離心管，1 000 r/min離心7 min，棄上清液。冰水低滲10 min，1 000 r/min離心7 min。用卡諾固定液(甲醇 ∶冰乙酸=3 1，現(xiàn)配現(xiàn)用)固定2～3次，每次15 min，1 000 r/min離心7 min。吹打混勻細(xì)胞，滴片后自然風(fēng)干，用Giemsa染液染色15 min，沖洗后自然晾干。

1.2.6 核型分析

用Olympus正置顯微鏡低倍鏡查找分裂相，再用油鏡拍照。選取126個(gè)分散良好、圖像清晰、數(shù)目完整的中期分裂相統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。并從中選取5個(gè)分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相，利用Photoshop、Image J軟件放大圖像并參考Levan等[5]提出的染色體類型劃分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)5個(gè)分裂相進(jìn)行參數(shù)測(cè)量分析，染色體相對(duì)長(zhǎng)度=(染色體長(zhǎng)度/染色體組總長(zhǎng))×100；臂比=長(zhǎng)臂/短臂，制作染色體核型圖。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞DNA相對(duì)含量

以彭澤鯽紅細(xì)胞為內(nèi)參，利用流式細(xì)胞儀對(duì)雜交四倍體子代紅細(xì)胞DNA相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖，橫坐標(biāo)表示紅細(xì)胞熒光值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。彭澤鯽平均熒光值約為301.24±2.42，雜交四倍體子代熒光值約為405.79±3.18，二者DNA相對(duì)含量比為0.74，即雜交四倍體子代為四倍體。

圖1 兩種子代紅細(xì)胞DNA相對(duì)含量測(cè)量峰圖

2.2 紅細(xì)胞形態(tài)比較

彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代、彭澤鯽雌核發(fā)育子代血涂片經(jīng)Giemsa染液染色晾干后，在Olympus BX53正置顯微鏡油鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖版1。如圖所示，兩種魚(yú)紅細(xì)胞經(jīng)染色后細(xì)胞核顏色較深，核質(zhì)分明。彭澤鯽雌核發(fā)育子代紅細(xì)胞長(zhǎng)軸略短于雜交四倍體子代，從形態(tài)上看雜交四倍體子代更長(zhǎng)。由于倍性增加紅細(xì)胞發(fā)生異形的概率增高，因而雜交四倍體子代血涂片中發(fā)現(xiàn)較高比例的異形紅細(xì)胞，如啞鈴型紅細(xì)胞(黑色箭頭)、無(wú)核紅細(xì)胞(綠色箭頭)、多核紅細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)，而在彭澤鯽中異形紅細(xì)胞較少。

2.3 紅細(xì)胞大小比較

彭澤鯽雌核發(fā)育子代、彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：雜交四倍體子代紅細(xì)胞長(zhǎng)軸為彭澤鯽的1.13倍，差異極顯著(P<0.01)，但紅細(xì)胞短軸與彭澤鯽差異不顯著，四倍體子代紅細(xì)胞表面積、體積均極顯著地大于彭澤鯽(P<0.01)，分別為彭澤鯽的1.08、1.22倍。因而在顯微鏡下可以觀察到雜交四倍體子代紅細(xì)胞更大、更長(zhǎng)，彭澤鯽紅細(xì)胞呈小且圓的橢圓形。在紅細(xì)胞核方面，四倍體子代的長(zhǎng)軸、核表面積、核體積極顯著地大于彭澤鯽(P<0.01)，分別為彭澤鯽的1.17、1.20、1.40倍，相同的是紅細(xì)胞核短軸二者差異不顯著。

表1 彭澤鯽雌核發(fā)育子代、彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞及核大小比較

2.4 肌肉、鰭條組織細(xì)胞培養(yǎng)

兩種子代肌肉、鰭條組織塊接種到T25培養(yǎng)瓶后生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖版Ⅱ、Ⅲ。如圖所示，兩種子代肌肉、鰭條組織塊貼壁情況較好，細(xì)胞圍繞組織塊呈發(fā)散狀生長(zhǎng)。彭澤鯽組織塊3 d開(kāi)始遷出細(xì)胞；7 d時(shí)在組織塊周圍有梭狀細(xì)胞迅速生長(zhǎng)；9 d時(shí)組織塊之間細(xì)胞接觸，生長(zhǎng)迅速；15 d時(shí)，一些組織塊周圍細(xì)胞堆積變形，生長(zhǎng)緩慢；18 d時(shí)基本鋪滿T25細(xì)胞瓶的80%，達(dá)到傳代要求。雜交四倍體子代同樣是3 d遷出細(xì)胞；5 d時(shí)已有組織塊之間細(xì)胞接觸生長(zhǎng)；10 d時(shí)生長(zhǎng)迅速；18 d時(shí)已經(jīng)達(dá)到傳代要求。傳代結(jié)果見(jiàn)圖版Ⅳ、Ⅴ，由于組織塊周圍細(xì)胞密集較難被胰酶消化下來(lái)，在傳代過(guò)程中一些細(xì)胞被胰酶過(guò)度消化導(dǎo)致細(xì)胞死亡(黑色箭頭)，懸浮在培養(yǎng)基中。相比于原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞增殖速度快，僅4～5 d就可以長(zhǎng)滿T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶。截至目前，兩種子代細(xì)胞已經(jīng)傳代到第10代。

圖版Ⅳ 彭澤鯽子代肌肉、鰭條組織塊傳代培養(yǎng)(4×10)

圖版Ⅱ 彭澤鯽雌核發(fā)育子代肌肉、鰭條組織塊原代培養(yǎng)(4×10)

2.5 染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)

染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)觀察統(tǒng)計(jì)，染色體數(shù)目在160以下有5個(gè)細(xì)胞；161～170有3個(gè)細(xì)胞；171～180的有9個(gè)細(xì)胞；181～190的有23個(gè)細(xì)胞；191～200的有15個(gè)細(xì)胞；大部分完整的中期分裂相染色體數(shù)目在201～210條，占55.56%。染色體數(shù)目分布范圍廣泛，但是在這個(gè)范圍內(nèi)并沒(méi)有明顯的眾數(shù)。

表2 彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代染色體數(shù)目

2.6 染色體核型分析

按照Levan[6]的染色體劃分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)測(cè)量結(jié)果對(duì)染色體進(jìn)行分型，結(jié)果見(jiàn)圖版Ⅵ，其中包括42條中部著絲粒染色體(m)、64條亞中部著絲粒染色(sm)、62條亞端部著絲粒染色體(st)、32條端部著絲粒染色體(t)，染色體臂數(shù)(NF)為368，其核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368，未發(fā)現(xiàn)異型性染色體。

圖版Ⅵ 彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代染色體

3 討論

3.1 DNA相對(duì)含量與倍性

魚(yú)類遠(yuǎn)緣雜交可以獲得不同倍性的雜交后代[6]，但是僅通過(guò)魚(yú)類體表特征很難鑒定魚(yú)類的倍性。常用的倍性鑒定方法有相對(duì)DNA含量測(cè)定法、紅細(xì)胞體積測(cè)量法、染色體數(shù)目及核型分析法[7]。DNA作為主要的遺傳信息，其含量與倍性呈正比關(guān)系[8-9]，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定其相對(duì)含量可以迅速、直接地反映魚(yú)類染色體倍性，這種方法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)魚(yú)體的傷害小、自動(dòng)化、快速高通量且準(zhǔn)確度高。目前，通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定倍性已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于動(dòng)、植物中，如陳落落等[10]通過(guò)此方法鑒定出二倍體、三倍體虹鱒；方禮豹等[8]采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法鑒定出二倍體、四倍體泥鰍及大鱗副泥鰍雜交四倍體子代的倍性；劉少軍[6]通過(guò)此方法鑒定鯽魴、鯽鲌等多種四倍體魚(yú)類的倍性。另外，在馬鈴薯[11]、毛竹[12]等多種植物倍性鑒定上也廣泛運(yùn)用此技術(shù)。本研究中，將三倍體彭澤鯽作為內(nèi)參，測(cè)定雜交四倍體子代紅細(xì)胞相對(duì)DNA含量約為內(nèi)參的1.33倍，即該雜交四倍體子代為四倍體，這一結(jié)果與桂建芳等[13]利用異源精子誘導(dǎo)異育銀鯽雌核發(fā)育其子代可能存在四倍體的研究結(jié)果一致。本研究也表明，通過(guò)選取合適的內(nèi)參，流式細(xì)胞術(shù)是一種快速、可靠鑒定倍性的方法。

3.2 紅細(xì)胞形態(tài)、大小的比較

紅細(xì)胞體積測(cè)量法也是輔助鑒定魚(yú)類倍性的常用方法，其原理是細(xì)胞中染色體數(shù)目或DNA的含量與細(xì)胞核的大小呈正比[14]，且細(xì)胞總是維持穩(wěn)定的核質(zhì)比[15]。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于材料易得、易行直觀。本研究中雜交四倍體子代紅細(xì)胞長(zhǎng)徑略大于彭澤鯽，其形態(tài)相較于彭澤鯽雌核發(fā)育子代更長(zhǎng)。同時(shí)我們?cè)陔s交四倍體子代中發(fā)現(xiàn)了許多啞鈴狀核、無(wú)核、多核等變異紅細(xì)胞。這些異形現(xiàn)象在多倍體紅細(xì)胞中是客觀存在的[16]。同時(shí)在現(xiàn)有的鯽、草魚(yú)、鯉、鳙等硬骨魚(yú)類血涂片研究中都發(fā)現(xiàn)有紅細(xì)胞分裂的現(xiàn)象[16]，因而推測(cè)這種異形紅細(xì)胞可能是由于紅細(xì)胞分裂導(dǎo)致；也可能由于倍性的增加，部分紅細(xì)胞難以維持穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞變形；此外有研究表明，饑餓脅迫也會(huì)影響紅細(xì)胞形態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)生不規(guī)則形狀或異形核紅細(xì)胞[17]。但是這種現(xiàn)象在彭澤鯽中極少，因而這一異形現(xiàn)象也可以成為判斷倍性的依據(jù)。本研究中雜交四倍體子代紅細(xì)胞體積是彭澤鯽的1.22倍，核體積是彭澤鯽的1.40倍，但與預(yù)測(cè)理論值1.33不符。這一結(jié)果與陳落落等[10]、俞小牧等[18]研究結(jié)果相似。導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果與理論值偏差與紅細(xì)胞的生長(zhǎng)受到許多因素的影響有關(guān)，如魚(yú)類年齡大小、性別、生活環(huán)境、生長(zhǎng)代謝情況等。同時(shí)本研究在同一張血涂片中也觀察到了大小不同的紅細(xì)胞，這是因?yàn)檫@些細(xì)胞處在不同的生長(zhǎng)時(shí)期。與本研究不同的是，鄒曙明等[19]在同源四倍體和三倍體團(tuán)頭魴紅細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)其體積并未隨倍性增加而增大。這表明不同魚(yú)類紅細(xì)胞大小是有差異的，單純依靠紅細(xì)胞測(cè)量法鑒定倍性可能不準(zhǔn)確，因而結(jié)合上述流式細(xì)胞術(shù)對(duì)魚(yú)體進(jìn)行倍性鑒定更為可靠。

3.3 組織細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本的制備

魚(yú)類的肌肉和鰭條組織具有極強(qiáng)的再生能力，遷出細(xì)胞的效果較好，又易于貼壁生長(zhǎng)，是培養(yǎng)原代細(xì)胞的理想材料，同時(shí)染色體數(shù)目以及核型分析也是細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)閮煞N子代規(guī)格較小，取頭腎等方法均不適用，因而選取了肌肉、鰭條組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種組織遷出的細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，通常3 d就可以達(dá)到再次傳代的要求，目前可以傳代到10代以上，但能否建立細(xì)胞系仍需進(jìn)一步研究。此外，有研究表明，不同濃度的秋水仙素、低滲、固定液比例、滴片高度、冷熱滴片法等因素會(huì)影響染色體的形態(tài)。在制備染色體標(biāo)本時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)提前12 h更換培養(yǎng)基會(huì)使細(xì)胞狀態(tài)較好，染色體中期分裂相更多，形態(tài)更清晰；冰水低滲效果在15 min為宜，否則離心后細(xì)胞較少，但是隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞越來(lái)越難漲開(kāi)，可能是由于細(xì)胞在多次傳代后衰老，已經(jīng)過(guò)了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞狀態(tài)不好；由于染色體數(shù)目較多，固定液最佳比例為甲醇 ∶冰醋酸=2 ∶1；離心速度不能超過(guò)1 000 r/min，否則細(xì)胞容易脹破；滴片高度要大于1 m。

3.4 染色體數(shù)目及核型分析

染色體是遺傳信息的載體，是生命體進(jìn)化的基礎(chǔ)，同時(shí)染色體分析也是鑒定雜交四倍體子代倍性、遺傳組成最直接、最準(zhǔn)確的方法[20]。近年來(lái)，許多研究者對(duì)不同地區(qū)鯽以及雜交鯽進(jìn)行了倍性鑒定和染色體核型分析的研究，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同地區(qū)鯽、雜交鯽核型分析結(jié)果

由表可知不同地區(qū)鯽以及雜交鯽的核型公式均有不同。例如貝爾鯽與銀鯽均為三倍體但核型公式卻不同；銀鯽的染色體核型與野生鯽呈倍性關(guān)系；雜交鯽后代染色體核型公式會(huì)因父母本的不同而不同等，這些現(xiàn)象說(shuō)明在鯽的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了染色體數(shù)目的加倍以及結(jié)構(gòu)變異，同時(shí)這種核型的差異性也可能是因?yàn)榈乩矸N群的差異或研究方法、測(cè)量誤差所致。本實(shí)驗(yàn)中，興國(guó)紅鯉是二倍體，核型公式為2n=28m+22sm+50st，NF=150；彭澤鯽是公認(rèn)的三倍體，染色體數(shù)目為3n=150+，其核型公式為3n=33m+51sm+33st+33t[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)126個(gè)染色體中期分裂相計(jì)數(shù)、測(cè)量分析得知：雜交四倍體子代的染色體數(shù)目分布范圍較廣，在150～210均有分布，其中200～210條占55.56%，但沒(méi)有明顯的眾數(shù)。因而我們推測(cè)雜交四倍體子代的染色體繼承了彭澤鯽的150+染色體以及本興國(guó)紅鯉配子的染色體，其核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368。造成分布范圍廣的原因可能是在制備染色體標(biāo)本時(shí)細(xì)胞疊加導(dǎo)致染色體增加或者滴片時(shí)染色體丟失[28]。在鯽的染色體研究中并不缺乏染色體數(shù)目不確定的情況，如銀鯽。有研究表明二倍體銀鯽染色體數(shù)目為100；三倍體為150或由150條基本染色體和6條或8～12條超數(shù)染色體組成；四倍體則為206條[29-30]，這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但是我們發(fā)現(xiàn)雜交四倍體子代核型公式與彭澤鯽加興國(guó)紅鯉配子核型公式并不相同，這可能由以下原因?qū)е拢涸诩?xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，染色體呈現(xiàn)周期性變化，盡管有絲分裂中期是最好的觀察時(shí)期，但仍受外界環(huán)境影響，例如制備染色體過(guò)程中秋水仙素的濃度、培養(yǎng)溫度等因素會(huì)導(dǎo)致染色體縮短，細(xì)胞狀態(tài)、低滲液種類及處理時(shí)間、固定液比例、滴片高度、冷熱滴片法等因素會(huì)影響染色體的形態(tài)；精卵結(jié)合后，染色體發(fā)生重組；實(shí)驗(yàn)方法的不同以及測(cè)量過(guò)程中的誤差等[23]。

小島吉雄[31]將真骨魚(yú)類劃分為低位類、中位類和高位類3個(gè)演化類群。從低位類群到高位類群，染色體越收斂，端部著絲粒染色體越多，染色體臂數(shù)越少。根據(jù)吳政安[32]研究結(jié)果：中部、亞中部著絲粒染色體較多屬于低位類；反之，為高位類型。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，中部、亞中部染色體共101條，占50.5%，即彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代屬于中位類群。

4 小結(jié)

綜上所述，采用三種方法對(duì)彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代倍性鑒定結(jié)果為四倍體，其染色體核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368。理論上該雜交四倍體子代遺傳了彭澤鯽和興國(guó)紅鯉的染色體，但仍需要對(duì)其染色體組成進(jìn)一步分析。由于遠(yuǎn)緣雜交四倍體子代可能會(huì)體現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)，有關(guān)雜交四倍體子代在生長(zhǎng)、形態(tài)、抗病等優(yōu)勢(shì)有待進(jìn)一步研究。

圖版Ⅲ 彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代肌肉、鰭條組織塊原代培養(yǎng)(4×10)

Plate Ⅲ Primary culture of muscle and fin tissue blocks ofC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensis(4×10)

1.2 d肌肉組織塊貼壁；2.2 d鰭條組織快貼壁；3.3 d開(kāi)始遷出細(xì)胞；4.5 d細(xì)胞生長(zhǎng)迅速；5.10 d時(shí)組織塊遷出細(xì)胞接觸，生長(zhǎng)迅速；6.15 d組織塊周圍細(xì)胞密集，變形；7.18 d細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%

圖版Ⅴ 彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代肌肉、鰭條組織塊傳代培養(yǎng)(4×10)

Plate ⅤC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensissubculture of muscle and fin tissue of hybrid progeny (4×10)

1.代傳1 d；2.傳代2 d；3.傳代4 d；4.傳代5 d；黑色箭頭為死亡細(xì)胞

圖版Ⅰ 彭澤鯽雌核發(fā)育子代、彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞(100×10)

Plate I red blood cells (100 × 10) of inbred progenies ofC.auratusvar.pengsenensisand hybrid progeny ofC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensis

圖1～2.彭澤鯽雌核發(fā)育子代紅細(xì)胞圖；3～4.彭澤鯽♀×興國(guó)紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞圖；藍(lán)色箭頭為多核紅細(xì)胞；綠色箭頭為無(wú)核紅細(xì)胞；黑色箭頭為啞鈴型紅細(xì)胞