草菇自溶過(guò)程中果膠酶及纖維素酶的活力變化*

劉靜華，歐陽(yáng)鈺，鐘舒雅，馬鈺霖，陳詩(shī)依，吳 偲，劉 主

（韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

草菇（Volvariella volvacea），擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycatina） 層菌綱 （Hyoenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 光柄菇科 （Pluteaceae） 草菇屬（Volvariella）[1]。因在稻草上生長(zhǎng)得名，又名稈菇、蘭花菇、南華菇、中國(guó)蘑菇、美味包腳菇等。草菇具有較高的營(yíng)養(yǎng)成分與保健價(jià)值。草菇含8種人體必需氨基酸，占其氨基酸總量的38．2%。草菇含有多糖類物質(zhì)，能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[2]。同時(shí)草菇屬于低升糖指數(shù)食物，是糖尿病患的理想食物。草菇屬于高溫型腐生真菌，在10℃～44℃、相對(duì)濕度80%～95%時(shí)生長(zhǎng)旺盛[3]。最適保存溫度為15℃，高于或低于15℃均容易發(fā)生軟化自溶[4]。草菇自溶可能是由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞壁成分降解所致。草菇的細(xì)胞壁含有果膠和纖維素等的物質(zhì)，認(rèn)為與草菇自溶有關(guān)[5]。通過(guò)測(cè)定不同溫度下草菇自溶過(guò)程中果膠酶和纖維素酶的活性變化，以期探討草菇自溶與這兩種酶活性的變化關(guān)系，以期為草菇保鮮提供參考。

1 草菇細(xì)胞壁成分影響酶

1.1 果膠酶

果膠主要是由D－半乳糖醛酸以α－1,4糖苷鍵連接而成的直鏈聚合物[6]。果膠酶（pectinase） 是指能夠催化果膠質(zhì)分解的多種酶的總稱[7]。果膠酶一般包含果膠酯酶 （pectinesterase）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）、果膠裂解酶 （pectate lyase） 3種。酯酶水解果膠酯成為果膠酸和甲醇；解聚酶分為果膠水解酶和果膠裂解酶，可斷開(kāi)果膠中部分D-半乳糖醛酸的α-1，4糖苷鍵[8-10]；真菌分解果膠類物質(zhì)的酶主要是果膠裂解酶。果膠酶瓦解細(xì)胞壁中的果膠成分，破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致果實(shí)軟化腐敗。故果膠酶與草菇自溶理論上存在一定的關(guān)系[11]。

1.2 纖維素酶

纖維素酶（cellulase）是一種多組分復(fù)合酶，包含C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶3種。其中C1酶可水解天然纖維素成為無(wú)定形纖維素，Cx酶可將其繼續(xù)水解為纖維寡糖，β-葡萄糖苷酶進(jìn)一步水解纖維寡糖成為葡萄糖。研究認(rèn)為，纖維素酶在某些水果如青梅[12]、桃[13]、甜櫻桃[14]果實(shí)的軟化中起主要作用。近年來(lái)對(duì)纖維素酶的研究顯示，纖維素酶與果實(shí)早期的成熟軟化有著密切聯(lián)系[15]，薛炳燁等[16]發(fā)現(xiàn)纖維素酶活性的升高是肥城桃果實(shí)硬度下降的首因。Tonutti等[17]報(bào)道，桃的果實(shí)在呼吸躍變前只有pI6.5的纖維素酶同工酶表現(xiàn)活性，呼吸躍變后出現(xiàn)了pI6.5和pI9.5共2種纖維素酶同工酶。部分真菌的細(xì)胞壁含有纖維素[18]，纖維素酶能分解細(xì)胞壁中的纖維素，從而使細(xì)胞壁遭到破壞。因此纖維素酶也可能與草菇的自溶有關(guān)。

2 試驗(yàn)材料和方法

2.1 試驗(yàn)材料

草菇菌株V23，實(shí)驗(yàn)室保存；D-半乳糖醛酸，北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司；葡萄糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；醋酸鈉緩沖液（0.2 mol·L-1，pH 4.8），西隴化工有限公司；0.25%果膠溶液，浙江一諾生物科技有限公司；二硝基水楊酸試劑（DNS試劑），天津福辰；羧甲基纖維素鈉溶液（CMC-Na溶液），天津市大茂化學(xué)試劑廠；Ultrospec 2000紫外分光光度計(jì)，Pharmacia Biotech；HH-S28s恒溫水浴鍋，金壇市環(huán)保儀器廠；冰箱，華凌；恒溫培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 草菇粗酶液制備

選取新鮮無(wú)損傷、無(wú)褐變的草菇子實(shí)體1 000 g，無(wú)菌水洗凈擦干，分為2組，每組各500 g，分別放置于4℃、30℃保存。4℃條件下，每隔2 d觀察草菇的自溶情況，加雙蒸水提取20 g草菇的液汁為粗酶液進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)，共觀察采樣8次；由于高溫條件下，草菇自溶較快，30℃保存的草菇每隔1 d觀察其自溶情況，加雙蒸水提取20 g草菇液汁作為粗酶液進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)，共觀察采樣8次。

2.2.2 果膠酶的活力測(cè)定

果膠酶酶活力測(cè)定常用方法包括還原法、粘度法、還原糖法（DNS法） 等[16-17]。選用更精確的DNS法測(cè)定草菇果膠酶酶活力。3,5-二硝基水楊酸（DNS）與醛糖共熱能夠產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖量與呈色物溶液顏色成正比，以標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定待測(cè)液吸光值可算出半乳糖醛酸含量，從而計(jì)算果膠酶酶活力。

1）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取100 mg分析純半乳糖醛酸，用pH 4.8醋酸鈉緩沖液配制成濃度為l mg·mL-1的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支刻度具塞試管，分別加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入1.5 mL DNS液混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即用流水冷卻至室溫，每管加蒸餾水稀釋到12.5 mL，搖勻，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，以光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）DNS法測(cè)定果膠酶酶活力

取2支試管，各加入0.90 mL的0.25%果膠底物溶液（醋酸鈉緩沖液配置），置于恒溫水浴箱37℃保溫5 min。其中1號(hào)管（空白管） 加0.20 mL煮沸失活的粗酶液，2號(hào)管（樣品管） 加入粗酶液0.20 mL，將2支試管置于恒溫水浴箱37℃溫浴30 min；向各管加入DNS試劑1.50 mL混合均勻，終止反應(yīng)；沸水浴5 min；流水冷卻試管；向試管分別加入雙蒸水7.40 mL，混勻；540 nm波長(zhǎng)下，以空白管調(diào)零，測(cè)樣品管吸光度，通過(guò)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量，酶活力（X1，U·mL-1）的計(jì)算公式為：

式中：G1為半乳糖醛酸含量（mg）；30為保溫時(shí)間，即酶與底物作用時(shí)間（min）；Ew為粗酶液的體積（mL）。

一個(gè)酶活力單位指在37℃、pH 4.8的條件下，每分鐘催化果膠水解成1 μmoL半乳糖醛酸的酶量。

2.2.3 纖維素酶酶活力測(cè)定

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取100 mg分析純無(wú)水葡萄糖（預(yù)先在105℃干燥至恒重），用蒸餾水，配制成濃度為 1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支刻度具塞試管，分別加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，加入1.5 mL DNS液（3，5-二硝基水楊酸試劑）混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即用流水冷卻至室溫，每管加蒸餾水稀釋到12.5 mL，搖勻，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）濾紙法（FPA） 測(cè)定纖維素酶酶活力

濾紙含有聚合度、結(jié)晶度適中的纖維素，可以定性濾紙為底物，經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，以還原糖的量來(lái)對(duì)標(biāo)纖維素酶系總的糖化能力。即為濾紙酶活（FPA），此法應(yīng)用廣泛，且能夠反映3類酶組分的協(xié)同作用[19]。取2支刻度具塞試管，1號(hào)為空白管，2號(hào)為樣品管。分別向2支管中加入0.05 mol·L-1醋酸鈉緩沖溶液 （pH 4.8） 2.00 mL，空白管則加入煮沸失活后的纖維素粗酶液1.00 mL，樣品管中加入粗酶液1.00 mL，均使管內(nèi)溶液浸沒(méi)濾紙（3 cm×2 cm，揉成團(tuán)），蓋塞。將2支試管同時(shí)置于50℃水浴鍋中水浴60 min。取出后立即加入DNS試劑3.00 mL，搖勻。將2支管同時(shí)放入沸水浴中水浴10 min，取出迅速冷卻至室溫，每管內(nèi)容物用重蒸水稀釋到25.00 mL，搖勻。520 nm波長(zhǎng)下，以空白管調(diào)零，測(cè)樣品管吸光度，通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量，酶活力（X2，U·mL-1）的計(jì)算公式為：

式中：G2為葡萄糖含量（mg）；60為保溫時(shí)間，即酶與底物作用時(shí)間（min）；Ew為粗酶液的體積（mL）。

一個(gè)酶活力單位指在50℃、pH 4.8的條件下，每分鐘催化纖維素水解成1 μmol葡萄糖的酶量。

3） 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 法測(cè)定纖維素酶酶活力

纖維素酶能降解CMC-Na生成葡萄糖等還原糖，再用DNS法顯色，用標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，520 nm處測(cè)其吸光度[20]。取2支刻度具塞試管，1號(hào)為空白管，2號(hào)為樣品管。分別向2管中加入CMC-Na溶液1.00 mL，空白管中加入煮沸失活后的纖維素粗酶液0.50 mL，樣品管中加入粗酶液0.50 mL，混勻，蓋塞。將2支試管同時(shí)置于50℃水浴鍋中水浴30 min。取出后迅速加入DNS試劑1.50 mL，搖勻。將試管同時(shí)放入沸水中水浴10 min，取出迅速冷卻至室溫，每管用重蒸水稀釋到12.50 mL，搖勻。520 nm波長(zhǎng)下，以空白管調(diào)零，測(cè)樣品管吸光度，通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量，酶活力（X3，U·mL-1）的計(jì)算公式為：

式中：G3為葡萄糖含量（mg）；30為保溫時(shí)間，即酶與底物作用時(shí)間（min）；Ew為粗酶液的體積（mL）。

一個(gè)酶活力單位指在50℃、pH 4.8的條件下，每分鐘催化纖維素水解成1 μmol葡萄糖的酶量。

3 結(jié)果與分析

3.1 草菇高溫自溶對(duì)比

草菇自溶前后的對(duì)比見(jiàn)圖1。

圖1 草菇自溶前后對(duì)比圖Fig.1 Volvariella volvacea before and after autolysis

由圖1所示，草菇自溶的過(guò)程中，外觀色澤逐漸變褐色，氣味從鮮菇味變?yōu)橛写瘫钱愇?，菇體從硬實(shí)有彈性變?yōu)檐浰砻娉霈F(xiàn)粘液、出水，為草菇自溶過(guò)程發(fā)生軟化，液化現(xiàn)象。

3.2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

由圖2可知，利用Excel 2010繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)；對(duì)測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)值為0.056 0，P值為0.009 1（P<0.01），差異極顯著。R接近于1，說(shuō)明其相關(guān)性較大。

圖2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of galacturonic acid

3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose

由圖3所示，利用Excel 2010繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)；對(duì)測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)值為0.415 3，P值為0.006 9（P<0.01），差異極顯著。R接近于1，說(shuō)明其相關(guān)性較大。

3.4 低溫自溶結(jié)果

草菇4℃儲(chǔ)存條件下果膠酶活力變化曲線見(jiàn)圖4。

圖4 4℃條件下果膠酶活力變化曲線Fig.4 Variation curve of pectinase activity at 4℃

由圖4可知，隨著冷藏時(shí)間的增加，果膠酶活力在草菇自溶前期趨于不變，但在自溶第12天時(shí)突然上升之后又下降；說(shuō)明低溫條件下，果膠酶在草菇自溶后期會(huì)產(chǎn)生有一定的影響。不同方法測(cè)定4℃儲(chǔ)存條件下纖維酶的活力變化曲線見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 4℃條件下CMC-Na法測(cè)定纖維酶的活力變化曲線Fig.5 Variation curve of cellulase activity by CMC-Na at 4℃

由圖5、圖6可知在草菇自溶前期，纖維素酶活性先上升后下降，后又趨于穩(wěn)定。說(shuō)明低溫條件下，纖維素酶影響草菇的自溶前期。由于FPA法能反映纖維素酶中3類酶組分的協(xié)同作用，而CMCNa法反映的是內(nèi)切葡聚糖酶的作用，所以從第6天、第8天、第10天的數(shù)據(jù)看，2種方法測(cè)得的酶活變化趨勢(shì)略有不同。

圖6 4℃條件下FPA法測(cè)定纖維素酶的活力變化曲線Fig.6 Variation curve of cellulase activity by FPA at 4℃

綜上，草菇在4℃低溫自溶過(guò)程中果膠酶與纖維素酶對(duì)草菇自溶都有一定的影響，但作用的時(shí)期不同。

3.5 高溫自溶數(shù)據(jù)表

草菇30℃儲(chǔ)存條件下果膠酶活力變化曲線見(jiàn)圖7。

由圖7所示，30℃處理?xiàng)l件下果膠酶在自溶第1天時(shí)，活力達(dá)到最大值，之后果膠酶活力隨著時(shí)間的增加，活力逐漸下降，后期變化趨于平穩(wěn)。不同方法測(cè)定4℃儲(chǔ)存條件下纖維酶的活力變化曲線見(jiàn)圖8、圖9。

圖7 30℃條件下果膠酶活力變化曲線Fig.7 Variation curve of pectinase activity at 30℃

由圖8、圖9可知，在草菇高溫自溶過(guò)程中纖維素酶活性均為先升高后降低，之后趨于穩(wěn)定，且在自溶第2天和自溶第3天時(shí)，纖維素酶的活力相近，達(dá)到最大值，說(shuō)明纖維素酶在草菇自溶中期有重要影響。

圖8 30℃條件下CMC-Na法測(cè)定纖維酶的活力變化曲線Fig.8 Variation curve of cellulase activity by CMC-Na at 30℃

圖9 30℃條件下FPA法測(cè)定纖維素酶的活力變化曲線Fig.9 Variation curve of cellulase activity at 30℃by FPA

4 結(jié)論

對(duì)比2組試驗(yàn)結(jié)果，草菇中果膠酶活性在低溫自溶和高溫自溶中變化趨勢(shì)不同。而草菇纖維素酶在低溫及高溫自溶中的變化趨勢(shì)相近。

草菇采后即切斷了外部環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，只能通過(guò)消耗自身糖類物質(zhì)產(chǎn)能進(jìn)行代謝活動(dòng)[21]。此時(shí)菇體內(nèi)的水解酶如果膠酶、纖維素酶作用于細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)中的果膠和纖維素，使自身降解、軟化、液化，甚至腐爛。試驗(yàn)表明，不管是低溫自溶還是高溫自溶，草菇內(nèi)纖維素酶與果膠酶的活力變化對(duì)其自溶均有一定的影響；且作用的時(shí)期和機(jī)制不同。果膠酶在草菇低溫自溶后期起主要作用；在高溫自溶前期起主要作用。而纖維素酶在草菇低溫及高溫自溶的前中期起主要作用。表明草菇軟化和自溶可能與果膠酶和纖維素酶的活性變化有關(guān)，且低溫自溶和高溫自溶的機(jī)制可能不同。對(duì)茶樹(shù)菇（Agrocybe aegerita）[22]、雙孢蘑菇 （Agaricus bisporus）[23]自溶機(jī)理與真空預(yù)冷技術(shù)的研究中，也提出在不同貯藏溫度下茶樹(shù)菇、雙孢菇內(nèi)果膠含量和果膠酶、纖維素含量和纖維素酶均有明顯差異。