高溫蒸汽對蠶卵微粒子病感染防治的研究探索

王霞，黃旭華，王平陽，張雨麗，崔秋英，唐亮，黃深惠，蔣滿貴*

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學研究院，南寧市 530007）

微孢子蟲是一類專性寄生細胞的單細胞真核生物，家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis，Nb）是一類寄生于家蠶細胞的微粒子病病原體［1］。蠶種檢疫是控制微粒子病大面積暴發(fā)的重要手段，而家蠶微孢子蟲是家蠶成品卵檢疫的唯一對象。微孢子蟲在家蠶體內(nèi)可通過蠶座及蠶室環(huán)境中存在病原而造成水平傳播，以及經(jīng)過胚種傳播兩種方式進行傳播，超過允許標準的帶毒蠶種需要整批淘汰，這常會給蠶種生產(chǎn)企業(yè)造成巨大損失，是蠶業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展的制約因素［2-3］。

防治家蠶微粒子病是蠶業(yè)生產(chǎn)的重點和難點。為了減少家蠶微孢子蟲病造成的經(jīng)濟損失，蠶種微孢子蟲的檢驗檢疫對減少蠶業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟損失具有關鍵作用。國內(nèi)外學者為了開發(fā)靈敏度高、特異性強、可行性強和成本低的檢測方法，對微粒子病進行了大量的探索性試驗研究［4-8］。在診斷技術(shù)方面，開發(fā)了包括應用染色技術(shù)、分子生物學技術(shù)、免疫學技術(shù)等方法診斷家蠶微孢子蟲??；在防治技術(shù)方面，主要是采用化學方法和物理方法來防治家蠶微粒子病，以防為主，防治結(jié)合?！胺馈敝饕羌訌姍z驗檢疫，將病原源頭控制??；“治”主要有化學防治和物理防治?；瘜W防治主要是應用化學藥物進行消毒和治療，針對家蠶微粒子病的消毒防病和藥物治病等手段，藥物消毒能夠使病原微生物的蛋白質(zhì)變性而使其失去致病力［9］，而藥物治療則是利用藥物的特異性來阻斷微孢子蟲原蟲增殖以達到治療該病的效果［10-11］。在物理防治技術(shù)上，研究者們也進行了大量的探索性試驗。物理防治主要包括溫湯浴種法、高溫即浸法及熱空氣處理法等［8］。研究發(fā)現(xiàn)溫湯浴種法和高溫即浸法（此處的高溫是相對于家蠶生理適溫24～28 ℃而言，設置為45～47 ℃）都可以對微粒子病起到防治作用。溫湯浴種法始于清代廣東地區(qū)的“浴水法預防微粒子病”。陳啟沅［12］將之記錄于《蠶桑譜》。高溫即浸法是將蠶卵浸泡于45～47 ℃的鹽酸處理一定時間后，利用鹽酸對蠶卵內(nèi)微孢子病原的消殺作用，從而減少其發(fā)?。?3-15］。家蠶微孢子蟲病是對蠶業(yè)生產(chǎn)危害最嚴重的病害之一，因此，對家蠶微孢子蟲病進行診斷治療對蠶業(yè)生產(chǎn)尤為重要。本試驗研究用高溫蒸汽處理蠶種后對家蠶微孢子蟲病的防治效果和對蠶卵孵化率的影響，以期為家蠶微粒子病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 供試病原與家蠶

兩廣二號、7 湘和9 芙等蠶種由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站提供。將7 湘原種和9 芙原種對交產(chǎn)下16 h 后的蠶卵用高溫蒸汽處理，之后進行浸酸、催青、孵化和調(diào)查處理。家蠶微孢子蟲Nb 由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站蠶病室提供，微孢子配制成1×107mL-1微孢子蟲懸液備用。

1.2 儀器

家蠶微粒子病熱療儀，由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站與廣西大革農(nóng)業(yè)科技有限公司聯(lián)合研制。

2 試驗方法

2.1 家蠶添食微孢子蟲

兩廣二號（CK）、7湘（原種）與9芙（原種）蠶種正常催青后飼養(yǎng)，在5齡起蠶后通過桑葉添食微孢子蟲孢子（每頭5 齡蠶添食10 μL 1×107mL-1微孢子蟲懸液），待家蠶食下后，用正常桑葉飼養(yǎng)，正常結(jié)繭化蛹、出蛾單卵圈制種、鏡檢。兩廣二號不作添食，正常上蔟結(jié)繭后調(diào)查繭層率、產(chǎn)卵量等數(shù)據(jù)。

2.2 高溫蒸汽處理蠶卵

將產(chǎn)下后的每個單蛾卵圈分成兩份，其中半個卵圈使用家蠶微粒子病熱療儀處理，分別在45 ℃、46 ℃、47 ℃、48 ℃、49 ℃的蒸汽下處理10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min（每個處理組均設3 個重復）后，常溫放置至產(chǎn)卵后20 h。另外半個蛾卵圈作為對照直接放置到產(chǎn)卵后20 h。隨后處理組和對照組均按常規(guī)方式浸酸5 min后催青，待收蟻后，每區(qū)隨機取60頭蟻蠶進行單頭鏡檢，調(diào)查數(shù)據(jù)，統(tǒng)計蠶卵微孢子相對防治效果及蠶卵孵化率。將家蠶正常飼養(yǎng)，待結(jié)繭化蛹后，調(diào)查繭重、繭層率及產(chǎn)卵量數(shù)據(jù)。技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 技術(shù)路線

2.3 數(shù)據(jù)分析

相對防治效果統(tǒng)計［16］：在出蟻后逐頭檢測蟻蠶的微孢子感染情況，計算其相對防治效果，相對防治效果（%）=（1－處理組檢出率/對照組檢出率）×100。

試驗數(shù)據(jù)生物統(tǒng)計：由GraphPad Prism 8.0 軟件統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 高溫蒸汽處理對家蠶微孢子蟲的殺滅效果

在5齡起蠶通過桑葉添食微孢子蟲懸液，正常飼養(yǎng)，單蛾卵圈制種后，對蠶卵進行高溫蒸汽處理。結(jié)果表明經(jīng)過不同溫度處理后，整體表現(xiàn)為高溫殺滅微孢子蟲的效果比對照組好，即溫度越高，相對防治效果越好；處理時間越長，相對防治效果越好（圖2）。在45 ℃和49 ℃條件下，殺滅效果隨處理時間延長而增強，49 ℃條件下的殺滅效果整體比45 ℃條件下的效果好；在46 ℃、47 ℃和48 ℃條件下，短期內(nèi)殺滅效果隨處理時間延長而增強，在30 min 左右達到閾值（圖2）。綜合分析，在47～48 ℃條件下處理30～40 min對蠶卵微孢子的相對防治效果最好。

圖2 不同溫度下不同處理時間對蟻蠶微孢子蟲相對防治效果

3.2 高溫蒸汽處理對蠶卵孵化率的影響

經(jīng)高溫蒸汽處理后的蠶卵，進行催青并統(tǒng)計孵化率以探討高溫蒸汽處理對家蠶蠶卵孵化率的影響。結(jié)果表明，在45～47 ℃處理條件下，不同處理時間的試驗組之間蠶卵的孵化率無顯著差異，與對照組的蠶卵孵化率相比，差異不顯著（圖3），說明該條件對蠶卵正常發(fā)育無影響。然而在48 ℃和49 ℃處理條件下，蠶卵孵化率隨處理時間延長而降低，說明處理時間較短時對蠶卵發(fā)育無顯著影響，但是處理時間較長時顯著影響蠶卵的生長發(fā)育（圖3）。結(jié)合高溫蒸汽對微孢子蟲的殺滅效果，認為47 ℃處理30 min是最優(yōu)組合。

圖3 不同溫度下不同處理時間對蠶卵孵化率的影響

3.3 高溫蒸汽處理蠶卵對其后續(xù)的繭重、繭層率、產(chǎn)卵量等影響

將高溫蒸汽處理后的蠶卵催青孵化，并在溫度為28 ℃和濕度為85%的條件下正常飼養(yǎng)，統(tǒng)計轉(zhuǎn)青時間、繭重、繭層率、產(chǎn)卵量等指標，以探討高溫蒸汽處理對家蠶性狀的影響。結(jié)果表明，高溫蒸汽處理對家蠶催青有影響，其中對照組的轉(zhuǎn)青時間為8 d，45～47 ℃處理組轉(zhuǎn)青時間為9 d，48 ℃處理組轉(zhuǎn)青時間為10 d；49 ℃處理組轉(zhuǎn)青時間達到11 d。正常飼養(yǎng)47 ℃處理30 min的家蠶和對照組的家蠶，調(diào)查繭重、繭層率、產(chǎn)卵量等數(shù)據(jù)，分析該處理對經(jīng)濟性狀的影響。結(jié)果表明優(yōu)選組合與對照組相比，繭重、繭層率、產(chǎn)卵量等經(jīng)濟指標均無顯著差異（圖4）。表明47 ℃高溫蒸汽處理蠶卵30 min可以在不影響家蠶正常發(fā)育和經(jīng)濟指標的前提下，高效殺滅微孢子蟲，在一定程度上達到防控家蠶微粒子病的目的。

圖4 家蠶繭重、繭層率、產(chǎn)卵量調(diào)查結(jié)果

4 討論

由于微孢子蟲對宿主可產(chǎn)生嚴重的危害，顯著影響宿主群體的正常生長發(fā)育，且具有較高致死率，對我國畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等造成巨大的損失。微孢子蟲能夠引發(fā)家蠶微粒子病，對蠶業(yè)生產(chǎn)造成毀滅性的危害，可通過飼養(yǎng)環(huán)境及野外昆蟲交叉感染，也可繼代感染［17］。刑東旭等［15］通過試驗說明利用高溫即浸處理感染微孢子蟲的蠶卵可以有效的防控微孢子蟲的胚種傳染。王璐［16］也證明，當家蠶卵齡為20 h 時，于高溫48 ℃下在濃度為1.075 g/mL 的鹽酸中浸酸6 min可以有效防治蠶卵微粒子病。刑東旭［15］和王璐［16］均推測高溫即浸是通過滅活蠶卵內(nèi)的微孢子蟲裂殖體，而非抑制微孢子蟲增殖的方法，達到防控微孢子蟲的繼代傳染的目的。基于這些研究，本研究采用高溫蒸汽浴處理感染微孢子蟲的家蠶卵，通過催青孵化逐頭檢測蟻蠶，統(tǒng)計各處理條件對家蠶微孢子蟲感染的防治效果，來檢測通過高溫蒸汽法能否達到同樣的防治微孢子蟲效果。結(jié)果顯示，高溫處理后蠶卵的轉(zhuǎn)青時間與對照組略有差異，普通蠶卵轉(zhuǎn)青時間為8 d，45～47 ℃處理組轉(zhuǎn)青時間為9 d，48 ℃處理組轉(zhuǎn)青時間為10 d；49 ℃處理組轉(zhuǎn)青時間達到11 d；46 ℃以下溫度處理40 min 以內(nèi)對家蠶蠶卵孵化率及其經(jīng)濟性狀無影響，但對蠶卵微孢子蟲防治效果差；47～49 ℃處理30～40 min 時蟻蠶微孢子蟲相對防治效果達到90%以上，但在48～49 ℃溫度條件下，隨著處理時間的延長，蠶卵孵化率有逐漸降低的趨勢，說明48～49 ℃的蒸汽處理對蠶卵的發(fā)育有一定的抑制作用，不僅影響蠶卵孵化率，同時也影響后期家蠶的蠶體生命力及其經(jīng)濟價值。綜合本試驗中蠶卵微孢子蟲的相對防治效果和蠶卵孵化率兩個研究結(jié)果，得出47 ℃高溫蒸汽處理30 min為最優(yōu)組合，該組合雖然對蠶卵的轉(zhuǎn)青時長有些影響，但其對蠶卵的孵化率及其后期飼養(yǎng)家蠶的經(jīng)濟性狀與對照組相比無顯著差異，無抑制作用，而且對蠶卵期的微孢子蟲感染的防治效果相對顯著。后續(xù)將增加感病對照組以及其他品種的的試驗結(jié)果研究，使得試驗設計得更加完善及嚴謹，后期將把試驗結(jié)果應用于生產(chǎn)中，檢驗此方法是否適用于生產(chǎn)實踐。