郝珊瑚，戰(zhàn) 瑩，王治國，武曉丹，張國旭

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110016

甲狀腺功能減退是由于甲狀腺激素合成及分泌減少導(dǎo)致的機體代謝降低的一種疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚干燥、脫發(fā)、便秘、易疲勞、睡眠障礙、抑郁等[1-2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來，甲狀腺切除術(shù)及放射性碘131(131Iodine,131I)治療導(dǎo)致的永久性甲狀腺功能減退不斷增加，臨床多采用甲狀腺素替代治療，而長期服用甲狀腺素會影響部分患者的身心健康。脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離出來的具有自我更新與多向分化潛能的多能干細胞。有研究表明，ADSCs可分泌多種生物活性因子，在組織損傷、修復(fù)方面具有重要作用[3]。本研究建立甲狀腺功能減低癥大鼠模型，旨在探討ADSCs治療甲狀腺功能減退的可行性及有效性。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只6周齡雄性SD大鼠(購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司)，體質(zhì)量150～172 g。飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物實驗科，飼養(yǎng)溫度18℃～23℃，相對濕度40%～70%，自由飲水?dāng)z食。每周觀察大鼠生存狀態(tài)，包括毛發(fā)情況、精神狀態(tài)、活動情況、飲食飲水情況等，測量并記錄大鼠體質(zhì)量變化。

1.2 模型構(gòu)建及實驗分組 40只大鼠隨機分成4組：陰性對照組，腹腔注射0.5 ml生理鹽水；131I模型組，腹腔注射250 μCi131I加入生理鹽水至0.5 ml；藥物對照組，在131I模型組基礎(chǔ)上，每天給予左甲狀腺素鈉片水溶液0.5 ml進行灌胃治療；ADSCs治療組，在131I模型組基礎(chǔ)上，4周后接受ADSCs移植。

1.3 干細胞的制備及移植 將人ADSCs細胞無菌條件下分離純化獲得脂肪組織，于37℃，5%CO2條件下，體外培養(yǎng)擴增4～7代細胞，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測表面標(biāo)記物，并進行細胞分化功能檢測，最終確定為合格細胞制品。ADSCs治療組尾靜脈注射ADSCs混懸液0.1 ml(密度為1×106個/ml)。

1.4 甲狀腺激素及炎性因子水平檢測 收集眼眥靜脈血1 ml，置聚丙烯EDTA抗凝管中，4℃下，以3 000 r/min離心10 min，取血清保存于-80℃冰箱中。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)及白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)水平。實驗步驟嚴(yán)格均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。吸光度值采用美國BIO-RAD伯樂550型酶標(biāo)儀測量，波長為450 nm。

1.5 甲狀腺131I靜態(tài)顯像 大鼠接受不同組內(nèi)干預(yù)措施后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，仰臥位固定，充分顯露頸部。分別向各組大鼠腹腔注入131I-碘化鈉顯像劑20 μCi，顯像劑由中國工程物理研究院物理與化學(xué)研究所提供。注射24 h后，行甲狀腺131I靜態(tài)顯像。甲狀腺131I靜態(tài)顯像采用德國Siemens公司Symbia T16 SPECT/CT儀，采用高能平行孔準(zhǔn)直器，采集矩陣128×128，每幀采集300 K計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較 實驗前，4組大鼠的體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陰性對照組大鼠在整個實驗過程中體質(zhì)量持續(xù)增長，其他3組大鼠注射131I后，體質(zhì)量增加緩慢，131I模型組與藥物對照組大鼠在第6周后，出現(xiàn)體質(zhì)量下降趨勢，而ADSCs治療組大鼠在干細胞移植后，體質(zhì)量逐漸上升。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較

2.2 各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較 注射131I前，各組大鼠TSH、FT3、FT4水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。注射131I后，藥物對照組、131I模型組、ADSCs治療組大鼠的FT3、FT4水平均低于陰性對照組，TSH水平高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與131I模型組比較，藥物對照組與ADSCs治療組大鼠的FT3水平均升高，F(xiàn)T4水平均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；藥物對照組與ADSCs治療組大鼠的TSH水平均低于131I模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠注射131I后血清甲狀腺激素水平比較

2.3 各組大鼠炎性因子水平比較131I模型組大鼠的TNF-α、IL-6水平明顯高于陰性對照組，1L-10水平明顯低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ADSCs治療組大鼠的TNF-α、IL-6水平顯著低于131I模型組，IL-10水平顯著高于131I模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。131I模型組與藥物對照組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-10水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠炎性因子水平比較

2.4 甲狀腺131I靜態(tài)顯像結(jié)果 注射131I前，各組大鼠甲狀腺均顯影清晰，大鼠輪廓清晰。注射131I后，各組大鼠輪廓清晰，甲狀腺區(qū)未見明顯放射性分布。藥物對照組服用左甲狀腺素鈉后，甲狀腺區(qū)未見明顯核素增濃，但ADSCs治療組經(jīng)過干細胞治療，甲狀腺床區(qū)可見放射性計數(shù)增加，甲狀腺較淡顯影。見圖3。

圖3 ADSCs治療組大鼠甲狀腺131I靜態(tài)顯像結(jié)果(a.注射131I前，大鼠輪廓清晰，可見消化道顯影，甲狀腺顯影清晰；b.注射131I后，大鼠輪廓清晰，可見消化道顯影，甲狀腺不顯影；c.移植干細胞后，大鼠輪廓清晰，可見消化道顯影，甲狀腺較淡顯影)

3 討論

甲狀腺是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺體，其功能是合成與分泌甲狀腺激素，調(diào)節(jié)人體正常物質(zhì)及能量代謝，促進機體生長發(fā)育。當(dāng)甲狀腺激素合成和分泌不足時，即發(fā)生甲狀腺功能減退。有研究表明，甲狀腺功能減退可導(dǎo)致心血管功能異常，顯著增加心血管疾病的發(fā)生率，還可引起血脂代謝紊亂、血壓升高，進而導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病的發(fā)生[3-4]。131I可以在體內(nèi)參與甲狀腺激素的合成和代謝過程，并放射β射線，對甲狀腺組織產(chǎn)生電離輻射作用，使濾泡細胞變性壞死，因此，臨床上利用131I治療甲狀腺疾病。本研究采用腹腔注射放射性131I的方法建立甲狀腺功能減低癥大鼠模型，具有操作簡便、成功率高、對機體損傷小的優(yōu)點，可以避免手術(shù)造模實驗動物存活率低的不足，同時可以減少化學(xué)誘導(dǎo)方法對大鼠其他器官的損害。

ADSCs是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，可以分化形成不同類型的組織器官的細胞，從而修復(fù)受損的組織[5-6]。通過體外培養(yǎng)，ADSCs可以被誘導(dǎo)分化成甲狀腺細胞，并且具有甲狀腺激素分泌功能[7]。本研究結(jié)果顯示，與131I模型組比較，藥物對照組與ADSCs治療組大鼠的FT3水平均升高，F(xiàn)T4水平均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；藥物對照組與ADSCs治療組大鼠的TSH水平均低于131I模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這可能是因為血清TSH水平較FT4更敏感，在發(fā)生甲狀腺功能減退早期，F(xiàn)T4還未檢測到異常時，TSH已經(jīng)發(fā)生改變[8]。TNF-α、IL-6、IL-10等是由免疫細胞及組織細胞經(jīng)刺激而分泌的具有生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細胞分化、增殖和誘導(dǎo)細胞發(fā)揮各種功能的作用，對于維持機體正常的生理狀態(tài)和抗御各種損傷具有重要意義[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，131I模型組大鼠的TNF-α、IL-6水平明顯高于陰性對照組，1L-10水平明顯低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示，131I誘導(dǎo)大鼠發(fā)生甲狀腺功能減退引起了機體的炎癥反應(yīng)，影響了免疫平衡及穩(wěn)定。TNF-α、IL-6的過度增殖與免疫細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)，在甲狀腺功能減退發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。TNF-α主要來源于單核巨噬細胞，可以抑制TSH的釋放，減少FT3、FT4的釋放，調(diào)節(jié)甲狀腺細胞的增殖[10]。IL-6主要來源于成纖維細胞、T淋巴細胞、內(nèi)皮細胞及單核細胞，具有多種生物活性，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、造血系統(tǒng)、急性期反應(yīng)與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面具有重要作用。有研究表明，IL-6濃度在甲狀腺功能減退的大鼠中增加[11]。Mikos等[12]報道，甲狀腺功能減退患者的TNF-α水平高于空白對照組，TNF-α被認為是甲狀腺功能減退的標(biāo)志物。IL-10主要由Th2細胞產(chǎn)生，可抑制巨噬細胞的活性，從而起到抗自身免疫炎癥的作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，ADSCs治療組大鼠的TNF-α、IL-6水平顯著低于131I模型組，IL-10水平顯著高于131I模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果表明，經(jīng)過干細胞治療后，大鼠的炎性因子水平有所改善，但直接補充甲狀腺激素僅能調(diào)節(jié)激素水平，并不能改善大鼠的炎性因子水平。甲狀腺131I靜態(tài)顯像結(jié)果顯示，131I模型組與藥物對照組未見甲狀腺顯影，ADSCs治療組輕微可見甲狀腺顯影。這提示，經(jīng)干細胞治療后，濾泡細胞功能部分恢復(fù)，行使其生理功能，這可能是因為ADSCs移植到大鼠體內(nèi)促使甲狀腺分泌功能增強，或其本身分化生成具有一定生物學(xué)功能的甲狀腺細胞，但具體原因有待進一步探究。

綜上所述，ADSCs移植可能會促進甲狀腺激素的分泌，改善甲狀腺的攝碘功能，對于放射性131I誘導(dǎo)后大鼠甲狀腺功能減退具有一定的潛在治療作用，其機制可能與促進IL-10的分泌有關(guān)。