NLRP3炎癥小體在重癥社區(qū)獲得性肺炎患者中的表達(dá)

周呈義 周國旗 劉振峰 鄒玉剛 鄒麗 陸小鳳 曾靜 羅先躍

1遵義市第一人民醫(yī)院（遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）核醫(yī)學(xué)科563000；2遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科563003

重癥社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)是ICU收治的常見疾病,自20世紀(jì)50年代抗菌素發(fā)明以來CAP雖然得到很好的治療,但是重癥CAP的高病死率一直未得到改善,仍保持在20%～50%[1]。即使近些年來抗生素發(fā)明和生命支持方法得到不斷進(jìn)步,但重癥CAP高病死率的現(xiàn)狀仍沒有得到改變。越來越多的研究認(rèn)為合適的免疫調(diào)節(jié)聯(lián)合抗生素治療可能會(huì)提高重癥CAP的治療效果和預(yù)后。固有免疫是機(jī)體抵抗病原體侵犯的第一道防線,而相應(yīng)的免疫受體及通路在固有免疫中發(fā)揮著重要作用,這些受體包括Toll樣受體家族、核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NOD-like receptors,NLRs)等。NLRP3炎癥小體是NLRs家族成員的組成之一,現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)其與凍傷蛋白相關(guān)周期性發(fā)熱綜合征、痛風(fēng)、糖尿病、牛皮癬、HIV-易感性增加、炎癥性腸病等有關(guān)[2]。近來的研究表明NLRP3炎癥小體的活化與某些肺部感染常見病原體有關(guān),但缺少相關(guān)的臨床研究。因此,本研究擬通過觀察CAP患者痰液及外周血單核細(xì)胞NLRP3炎癥小體及相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá),為臨床有效防治重癥CAP提供免疫學(xué)理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究經(jīng)倫理委員會(huì)同意后,隨機(jī)選取2018年4月至2019年4月于遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科住院的CAP患者20例,其中普通CAP患者12例,男9例(75.0%),女3例(25.0%),平均年齡(60.8±11.2)歲；重癥CAP患者8例,男4例(50.0%),女4例(50.0%),平均年齡(66.3±9.5)歲。另外選取同期于遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院體檢的健康人群10名作對照,男6名(60.0%),女4名(40.0%),平均年齡(61.0±7.7)歲。健康對照組個(gè)體的排除標(biāo)準(zhǔn):自身免疫疾病、人免疫缺陷病毒感染、腫瘤、懷孕、其他感染性疾病或肺部疾病。CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]為在胸部影像學(xué)提示急性肺部浸潤的基礎(chǔ)上合并以下條件中的至少2項(xiàng):(1)呼吸道癥狀,如咳嗽、咳痰等；(2)感染中毒癥狀,如畏寒、發(fā)熱等；(3)肺部異常體征,如濕性啰音；(4)炎癥指標(biāo)異常(如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白增高等)。利用ATS/IDSA 2007標(biāo)準(zhǔn)識別重癥CAP,重癥CAP入選標(biāo)準(zhǔn)[3]:(1)需要有創(chuàng)機(jī)械通氣；(2)感染性休克需要血管收縮劑治療。CAP的排除標(biāo)準(zhǔn):自身免疫性疾病,HIV感染,惡性腫瘤,懷孕,醫(yī)院獲得性肺炎,或者感染性疾病。收集所有研究對象的一般資料,同時(shí)進(jìn)行APACHEⅡ、SOFA、CURB 65評分判斷患者器官功能、病情嚴(yán)重程度。

1.2 主要試劑和儀器 主要儀器設(shè)備:NIKON光學(xué)顯微鏡購自日本NIKON公司,XW-80A型漩渦混合器購自精科公司,超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化公司,垂直電泳槽購自上海儀器總廠,電泳儀購自美國Bio-Rad公司,電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司,低溫離心機(jī)購自德國Backman,轉(zhuǎn)移槽DYCP-40C購自上海儀器總廠,恒溫箱購自德國ZEEnit700,IP Win32采圖系統(tǒng)購自美國Syngene公司,凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司,PCR儀購自美國Bio-Rad公司。主要試劑:Histopaque-1077液購自美國Sigma公司,淋巴細(xì)胞分離液購自寶生物工程(大連)有限公司,RPMI 1640購自美國BioWhittaker公司,兔抗人NLRP3抗體、兔抗人IL-1β抗體和兔抗人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體購自美國SANTA公司,PCR引物購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 標(biāo)本的獲取

1.3.1 血液標(biāo)本的獲取 在住院第1天、第3天和出院日抽取重癥CAP、普通CAP患者外周靜脈血,健康對照組抽取同期健康體檢者的外周靜脈血,所有的血液標(biāo)本均在7∶00和14∶00之間抽取2份,每份5 ml。1份加入等體積Histopaque-1077(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)液,混勻后室溫下600 r/min離心20 min(離心半徑為10 cm),按濃度梯度吸出單個(gè)核細(xì)胞層的細(xì)胞,用RPMI 1640(BioWhittaker,Walkersville,MD)洗2次,純化的單核細(xì)胞分離后立即進(jìn)行RT-PCR定量檢測；另一份行依地酸二鈉抗凝,4℃條件下1 200 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm),血漿于－20℃保存,用于蛋白質(zhì)印跡檢測。

1.3.2 痰液標(biāo)本的獲取 收取重癥CAP及普通CAP患者住院期間下呼吸道合格痰液(每低倍鏡視野下＜25個(gè)鱗狀上皮細(xì)胞,每高倍鏡視野下＞25個(gè)白細(xì)胞),健康對照組采取高滲鹽水誘導(dǎo)排痰收集,從痰液中分離痰栓,分為2份,1份稱重,按1 g加入4 ml 0.1%的二硫蘇糖醇攪拌混勻過濾,過濾液加入同體積的磷酸鹽緩沖液,4℃條件下1 500 r/min離心15 min(離心半徑為10 cm),懸浮細(xì)胞備用蛋白質(zhì)印跡檢測。

1.4 PCR檢測 利用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 mRNA表達(dá),將1μg單核細(xì)胞RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成DNA,然后進(jìn)行擴(kuò)增。使用正向引物5'-AAAAGACTCATCCGTGTGCC-3'和反向引物5'-TTCCTGGCATATCACAGTGG-3'檢測外周血中單核細(xì)胞的NLRP3 mRNA表達(dá)。同時(shí)使用正向引物5'-GGTCTTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'和反向引物5'-GACCCCTTCATTGACCTCAACTACA-3'測定每個(gè)樣品中GADPH m RNA的水平。在1%瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物,并在透照儀上拍攝數(shù)碼照片。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測 利用蛋白質(zhì)印跡檢測痰液細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞NLRP3、IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)。主要步驟:(1)標(biāo)本獲取,清洗后放入液氮中保存待檢測；(2)蛋白提取,將組織標(biāo)本放入裂解液中解凍,利用Bradford法檢測蛋白濃度；(3)電泳及轉(zhuǎn)膜,將20 mg蛋白標(biāo)本載入凝膠孔中進(jìn)行凝膠電泳,條件為20 V 30 min,結(jié)束電泳后將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上；(4)抗體孵育和檢測,先后用無標(biāo)記的一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育、檢測。利用1.46版本Image J軟件對蛋白質(zhì)印跡結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示,采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示,采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 結(jié)果顯示,重癥CAP組患者APACHEⅡ、SOFA、CURB 65評分均高于普通CAP組,同時(shí)重癥CAP組患者炎癥指標(biāo)(C反應(yīng)蛋白、降鈣素原)均高于普通CAP組；所有患者中有7例需要機(jī)械通氣,均為重癥CAP患者；另外,重癥CAP組治愈率明顯低于普通CAP組,且住院時(shí)間明顯增長。見表1。

表1 普通CAP組和重癥CAP組患者一般資料比較

2.2 蛋白質(zhì)印跡 利用蛋白質(zhì)印跡分別檢測痰液細(xì)胞的NLRP3、IL-1β和TNF-α表達(dá),結(jié)果顯示:普通CAP組及重癥CAP組痰液細(xì)胞的NLRP3表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細(xì)胞的NLRP3表達(dá)高于普通CAP組(P值均＜0.05)；普通CAP組及重癥CAP組痰液細(xì)胞的IL-1β表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細(xì)胞的IL-1β表達(dá)高于普通CAP組(P值均＜0.05)；普通CAP組及重癥CAP組痰液細(xì)胞的TNF-α表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細(xì)胞的TNF-α表達(dá)高于普通CAP組(P值均＜0.05)。見表2。

表2 各組痰液標(biāo)本中NLRP3、IL-1β和TNF-α表達(dá)比較(±s)

注:CAP為社區(qū)獲得性肺炎；TNF-α為腫瘤壞死因子α；與健康對照組比較,a P＜0.05；與普通CAP組比較,b P＜0.05

組別 例數(shù) NLRP3 IL-1β TNF-α健康對照組 10 0.20±0.14 0.65±0.17 0.94±0.18普通CAP組 12 0.98±0.17a 0.85±0.21a 1.13±0.12a重癥CAP組 8 1.16±0.17ab 1.09±0.20ab 1.21±0.09ab F值 114.813 4.469 10.327 P值 ＜0.001 0.021 ＜0.001

利用蛋白質(zhì)印跡分別檢測外周血單核細(xì)胞中的NLRP3、IL-1β和TNF-α表達(dá),結(jié)果顯示:普通CAP組及重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的NLRP3表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的NLRP3表達(dá)高于普通CAP組(P值均＜0.05)；普通CAP組外周血單核細(xì)胞中的IL-1β表達(dá)高于健康對照組(P＜0.05)；重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的TNF-α表達(dá)高于普通CAP組及健康對照組(P值均＜0.05)。見表3。

表3 各組外周血標(biāo)本中NLRP3、IL-1β和TNF-α表達(dá)比較(±s)

表3 各組外周血標(biāo)本中NLRP3、IL-1β和TNF-α表達(dá)比較(±s)

注:CAP為社區(qū)獲得性肺炎；TNF-α為腫瘤壞死因子α；與健康對照組比較,a P＜0.05；與普通CAP組比較,b P＜0.05

組別 例數(shù) NLRP3 IL-1β TNF-α健康對照組 10 0.66±0.51 0.44±0.19 0.36±0.18普通CAP組 12 1.23±0.25a 1.31±0.24a 0.45±0.16重癥CAP組 8 2.36±0.33ab 0.79±0.25 1.31±0.40ab F值 26.343 4.469 10.307 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 PCR檢測 利用RT-PCT檢測外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 mRNA表達(dá),結(jié)果顯示:普通CAP組及重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 mRNA表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 m RNA表達(dá)高于普通CAP組(P值均＜0.05)。見表4。

表4 各組外周血單核細(xì)胞中NLRP3 m RNA表達(dá)比較(±s)

表4 各組外周血單核細(xì)胞中NLRP3 m RNA表達(dá)比較(±s)

注:CAP為社區(qū)獲得性肺炎；與健康對照組比較,a P＜0.05；與普通CAP組比較,b P＜0.05

組別 例數(shù) NLRP3 m RNA健康對照組 10 0.31±0.35普通CAP組 12 0.46±0.65a重癥CAP組 8 0.64±0.78ab F值 21.429 P值 0.002

3 討論

CAP是全球急診科就診和住院治療的主要疾病之一,2014年美國急診科就診人數(shù)達(dá)423 000例。此外,重癥CAP患者需要較高的護(hù)理?xiàng)l件,例如進(jìn)入ICU[4]。據(jù)估計(jì),重癥CAP占所有ICU入院人數(shù)的6%,其中ICU死亡率為35%,整體院內(nèi)死亡率為50%[5]。CAP給社會(huì)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),并對患者造成了極大的死亡風(fēng)險(xiǎn)；因此,早期對重癥CAP識別和及時(shí)治療直接關(guān)系患者的預(yù)后。目前國際上已使用幾種常用的評分量化表對肺炎嚴(yán)重程度進(jìn)行分類并評估住院需求,比如肺炎嚴(yán)重程度指數(shù)和CURB 65等量化指標(biāo)。另外,ATS/IDSA 2007 CAP指南建議ICU入院的主要和次要標(biāo)準(zhǔn),主要標(biāo)準(zhǔn)是需要機(jī)械通氣和需要血管加壓藥的感染性休克。這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)也反映了2個(gè)最相關(guān)的CAP并發(fā)癥:急性呼吸衰竭和敗血癥,這些都與高病死率有關(guān)。既往研究已經(jīng)表明NLRP3炎癥小體在肺癌、COPD等多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[3],在除外慢性活動(dòng)性肺部疾病以外的CAP患者較少,入選本研究的所有患者均達(dá)到所需標(biāo)準(zhǔn),符合研究要求。

先天性免疫系統(tǒng)是宿主防御的第一道防線,其中種系編碼的模式識別受體活化對有害刺激(如病原體入侵、死細(xì)胞和環(huán)境刺激物等)的反應(yīng)起到至關(guān)重要的作用[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的模式識別受體有5種,其具有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域,包括NLR家族成員(如NLRP1、NLRP3和NLRC4),缺乏黑色素瘤2和pyrin等[7]。既往研究表明NLR家族中參與炎癥反應(yīng)的有NLRC4、NLRX1、NLRP1、NLRP3、NLRP10等[2],其中對NLRP3的研究較多。經(jīng)典NLRP3炎癥小體激活需要通過2種不同的信號,分別是啟動(dòng)和激活信號:首先啟動(dòng)信號增加前IL-1β和NLRP3轉(zhuǎn)錄,然后第二信號誘導(dǎo)其寡聚化,最終激活其生物學(xué)功能?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)闡明NLRP3能被多種刺激激活,如細(xì)胞外ATP[8]、石棉[9]和流感病毒[10],并參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制[11]。近來的研究表明NLRP3信號與肺部疾病有明顯相關(guān)性,如該信號與重癥哮喘氣道炎癥反應(yīng)程度有關(guān)[12],NLRP3炎癥小體的激活與病毒所致肺部損傷嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。Witzenrath等[14]的研究表明NLRP3炎癥小體激活可能參與肺炎鏈球菌性肺炎的發(fā)生,但缺少相關(guān)的臨床觀察研究。本研究通過APACHEⅡ、SOFA、CURB 65評分等方法將試驗(yàn)對象分為健康對照組、普通CAP組、重癥CAP組；利用蛋白質(zhì)印跡檢測痰液細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的NLRP3表達(dá)發(fā)現(xiàn)普通CAP組及重癥CAP組患者痰液細(xì)胞的NLRP3表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細(xì)胞的NLRP3表達(dá)高于CAP組；同時(shí)利用RT-PCT檢測外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 m RNA表達(dá),結(jié)果顯示:普通CAP組及重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 m RNA表達(dá)高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 m RNA表達(dá)高于普通CAP組。因此,筆者推測NLRP3炎癥小體的表達(dá)可能與CAP的發(fā)生發(fā)展有關(guān),并且可能與CAP的嚴(yán)重程度有關(guān),需要以后大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。

NLRP3作為一種跨膜結(jié)構(gòu)的受體分子[15],首先是機(jī)體免疫系統(tǒng)激活Toll樣受體后促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞等通過核轉(zhuǎn)錄因子κB通路促進(jìn)NLRP3和前IL-1β表達(dá)。然后是許多細(xì)胞事件的共同特征,膜滲透性或孔形成、溶酶體和線粒體損傷,以及活化氧產(chǎn)生等導(dǎo)致的K+外流可激活NLRP3炎癥小體[16]。最后,活化的NLRP3炎癥小體通過Caspase-1信號促進(jìn)IL-1β等炎癥因子產(chǎn)生,最終參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生。以上NLRP3信號通路已經(jīng)被證實(shí)不僅與肺部腫瘤性疾病有關(guān)[17],并且參與急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制[18]。然而,目前尚未完全闡明NLRP3信號通路在CAP中的作用機(jī)制。本研究利用蛋白質(zhì)印跡分別檢測痰液細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的IL-1β和TNF-α表達(dá),結(jié)果顯示:普通CAP組及重癥CAP組痰液細(xì)胞的IL-1β表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細(xì)胞的IL-1β表達(dá)高于普通CAP組；普通CAP組及重癥CAP組痰液細(xì)胞的TNF-α表達(dá)均高于健康對照組,重癥CAP組痰液細(xì)胞的TNF-α表達(dá)高于普通CAP組。另外,普通CAP組外周血單核細(xì)胞中的IL-1β表達(dá)高于健康對照組,重癥CAP組外周血單核細(xì)胞中的TNF-α表達(dá)顯著高于普通CAP組及健康對照組。本研究不足之處有:(1)由于樣本量較小并不能分析出CAP中NLRP3炎癥小體的敏感性與特異性,以及與其他炎癥標(biāo)志物的相關(guān)性；(2)由于既往研究證實(shí)NLRP3炎癥小體廣泛參與肺部疾病的發(fā)病機(jī)制,因此對肺部炎癥應(yīng)該不具有特異性,尚不能作為肺部疾病鑒別的生物標(biāo)志物,以上不足需以后大樣本、多中心的研究證實(shí)。

綜合以上研究結(jié)果可知,CAP患者NLRP3炎癥小體的表達(dá)增加,并且不同嚴(yán)重程度的CAP患者表達(dá)存在差異；同時(shí),伴隨CAP患者炎癥因子如IL-1β和TNF-α表達(dá)的變化。近來的研究表明[19]阻斷NLRP3可以減輕炎癥反應(yīng)并減少病原體感染的機(jī)會(huì)。由此總結(jié),NLRP3炎癥小體在CAP尤其重癥CAP中表達(dá)較高,推測NLRP3炎癥小體活化通路可能參與了CAP患者的炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)過程。然而,具體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及臨床意義需要進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突