黑莓中總花色苷的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性和抑菌性的研究

吳映梅，徐龍泉，浦紹敏，周艷*，周紹琴

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550000）

黑莓（blackberry），發(fā)現(xiàn)于北美洲，屬于一種藤本植物，隸屬于薔薇科，是已發(fā)現(xiàn)的第三代水果的代表種類之一[1]，果實豐富，色澤宜人，含有豐富的高效抗氧化物質(zhì)，比如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、花青素、鞣花酸和類黃酮等[2]。被一些歐洲國家稱之為“黑色鉆石”、“生命之果”。花色苷（anthocyanins）是一類天然色素，水溶性，極性大，屬于類黃酮的一種，在多種植物性食品中都有存在，存在部位多為植物的果實、莖葉和細胞液中[3-4]，花色苷種類很多，目前已從黑莓果實中分離出矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷[5]等不同種類的花色苷。由于花色苷顏色鮮艷、色質(zhì)好，常被用作著色劑，主要應(yīng)用于果汁飲料、罐頭和糖果等食品，如今被多個國家和地區(qū)允許按照需要量應(yīng)用[6]。

目前，花色苷的提取主要有有機溶劑萃取法[7]、酶提取法[8]、超聲、微波輔助提取法[9]及超臨界CO2提取法[10]。其中，有機溶劑萃取法因為其操作簡單，成本低，是最常用的提取方法。酸化醇溶液因為具有高效提取的特點，成為最常用的提取溶劑[3]。一般采用單因素和響應(yīng)面法對花色苷的最佳提取工藝進行優(yōu)化，譚永蘭等[11]采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果腺肋花楸殘渣花色苷提取工藝，得到最佳工藝，并且提取率較高。郭才南等[12]應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取白檀果實花色苷工藝，考察了不同因素對于花色苷提取率的影響。

黑莓具有調(diào)節(jié)機體機能、增強機體免疫力、延緩衰老等生理功能[13]，研究發(fā)現(xiàn)，黑莓花色苷針對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷有一定的積極保護作用[14]。除此之外，16世紀時，黑莓就被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，在歐洲被用來醫(yī)治細菌感染，有一定的抑菌作用[15]。越來越多的研究表明，黑莓花色苷對人體提高抗氧化應(yīng)激能力有積極作用，因此可以實現(xiàn)對人體的抗氧化保護作用[16-17]，但是目前黑莓藥用價值和食用價值方面的開發(fā)還很少，仍有待更進一步的深入探究。

本研究以黑莓作為原料，采用溶劑萃取法進行提取，運用單因素和響應(yīng)面法進行優(yōu)化，旨在得到黑莓中花色苷提取的最佳工藝，并且測定花色苷的抗氧化活性和抑菌性，為黑莓中花色苷的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍黑莓：萊陽瑞光食品有限公司，-18℃冷凍保存，備用。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：貴州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院微生物實驗室；甲醇、乙醇、鹽酸、磷酸、硫酸鐵、水楊酸、過氧化氫、DPPH：均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

TG16-WS臺式高速離心機：常州朗越儀器制造有限公司；721型紫外分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；DVP-9082型恒溫培養(yǎng)箱：上海潤度生物科技有限公司；PHS-3C型PH計：上海雷磁儀器有限公司；THZ-24-S型恒溫搖床：上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司；DXM-30R型高壓蒸汽滅菌鍋：上海高致精密儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 冷凍黑莓的預(yù)處理

將新鮮冷凍黑莓在常溫下（20℃）解凍后，加入適量蒸餾水，用榨汁機打碎成漿，將果漿放入-18℃冰箱保存，備用。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 黑莓中總花色苷提取的溶劑選擇

將10 g黑莓果漿分別加入到5個100 mL的三角錐形瓶中，分別用1%鹽酸-H2O、1%鹽酸-乙醇、1%鹽酸-甲醇、1%磷酸-甲醇、1%磷酸-乙醇，料液比為1∶4（g/mL），在溫度為 35℃的恒溫水浴鍋中提取60 min。然后在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min的條件下離心5 min后，得到上清液，用紫外分光光度計在其最大吸收波長下測定總花色苷吸光度并計算總花色苷。

1.2.2.2 提取黑莓中總花色苷的溫度選擇

將10 g黑莓果漿分別加入到5個100 mL的三角錐形瓶中，提取溶劑選擇1%HCl-甲醇，料液比為1∶4（g/mL），分別在 15、25、 35、45、55 ℃ 5 個不同溫度的恒溫水浴鍋中提取60 min，然后在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min的條件下離心5min后，得到上清液，用紫外分光光度計在其最大吸收波長下測定總花色苷吸光度并計算總花色苷。

1.2.2.3 提取黑莓中總花色苷的料液比選擇

將10 g黑莓果漿分別加入到5個100 mL的三角錐形瓶中，按照料液比 1∶1、 1∶2、 1∶4、 1∶6、 1∶8（g/mL），1%HCl-甲醇為提取溶劑，在溫度為35℃的恒溫水浴鍋中提取60 min。然后在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min的條件下離心5 min后，得到上清液，用紫外分光光度計在其最大吸收波長下測定吸光度并計算總花色苷。

1.2.2.4 提取黑莓中總花色苷的時間選擇

選取5個100 mL的三角錐形瓶，加入10 g黑莓果漿，分別在 40、50、 60、70、80 min，選 1%HCl-甲醇為提取溶劑，料液比為 1∶4（g/mL），在溫度為 35℃水浴鍋中提取60 min，然后在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min的條件下離心5 min，取上清液，用紫外分光光度計在其最大吸收波長下測定總花色苷吸光度并計算總花色苷。

1.2.3 黑莓中總花色苷含量的測定

用Okamura N等[18]、錢鐳等[19]的研究方法（稍作改動）進行測定，用移液管吸取2 mL制備好的樣品，分別用pH 1.0和pH 4.5的磷酸緩沖液將其稀釋10倍，振蕩搖勻，采用2 mL提取溶劑加18 mL的磷酸鹽緩沖液作為空白對照，分別在510 nm和720 nm處測定其吸光度。總花色苷含量計算公式如下。

式中：ACY為總花色苷含量，mg/g；DV為定容體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g；ε為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，2.96×104L/（mol·cm）；M為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾分子質(zhì)量，449.2 g/mol；VF為稀釋倍數(shù)；L為比色皿光程，1 cm。

1.2.4 黑莓中花色苷的提取條件響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，運用Box-Behnken組合試驗方法設(shè)計四因素三水平的試驗，以總花色苷含量為響應(yīng)值（R1），將響應(yīng)面試驗得到的數(shù)據(jù)利用Design-Expert軟件進行二次多元回歸擬合。試驗因子及水平如表1。

表1 試驗因子及水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.5 黑莓中總花色苷的抗氧化能力測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定

按照參考文獻[20]方法并稍作改動，采用無水乙醇溶解DPPH配制成一定濃度的混合溶液，置于棕色瓶，避光保存，備用。取5支10 mL具塞試管，將稀釋為5個不同濃度的總花色苷溶液各取1 mL，再加入4 mL的DPPH混合溶液，分別測定其吸光度A。

式中：A1為樣品組（樣品與DPPH溶液）吸光度；A2為樣品對照組（樣品與無水乙醇）吸光度；A0為對照組（70%乙醇與DPPH溶液）吸光度。

1.2.5.2 羥基自由基清除能力測定

取5支10 mL具塞試管，將稀釋成5個不同濃度的總花色苷粗提取液分別取1 mL加入試管，再在試管中添加9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，最后加入8.8 mol/L H2O22 mL，室溫（20℃）下反應(yīng)30 min，以蒸餾水調(diào)零，在510 nm處測定樣品的吸光度A[21]?？紤]到不同濃度的總花色苷溶液本身的吸光度值不同，故以不加顯色劑的一組的吸光度作為本底值。

式中：A0為1 mL蒸餾水+1 mL 9 mmol/L FeSO4+1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇+2 mL H2O2所測得的吸光度；A1為1 mL總花色苷溶液+1 mL 9 mmol/L FeSO4+1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇+2 mL H2O2所測得的吸光度；A2為1 mL總花色苷溶液+1 mL 9 mmol/L FeSO4+1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇+2 mL蒸餾水所測得的吸光度。

1.2.6 黑莓中總花色苷抑菌能力測定

1.2.6.1 供試菌種的活化

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為供試菌種，接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，置于37℃搖床培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完之后將培養(yǎng)基置于0℃～4℃冷藏備用[22]。

1.2.6.2 敏感性試驗

取10 mL供試菌種接種于滅菌培養(yǎng)基中，于37℃搖床中培養(yǎng)24 h，菌懸液濃度約為106CFU/mL～107CFU/mL[23]。在培養(yǎng)皿中傾倒25 mL已經(jīng)融化的瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基，等冷卻后將1 mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液涂布于培養(yǎng)基上，涂布均勻后，將已經(jīng)滅菌的牛津杯放置于培養(yǎng)基上，并各取0.1 mL的樣品加入牛津杯中，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，取出觀察抑菌圈，以滅菌的提取溶劑為空白對照。

1.2.6.3 最小抑菌濃度試驗

將已制備好的黑莓中總花色苷提取液用二倍稀釋法稀釋成7個不同濃度梯度的溶液，分別取1 mL于7支滅菌的試管中，加入4 mL培養(yǎng)基，振蕩，搖勻，然后將稀釋后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（105CFU/mL）接種于各試管中，將試管放入37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察其生長情況，以恰好不長菌的稀釋液的濃度為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 黑莓中總花色苷的提取溶劑選擇

提取溶劑對總花色苷含量的影響見圖1。

圖1 提取溶劑對總花色苷含量的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on anthocyanin content

由圖1可知，提取溶劑為1%的鹽酸-甲醇時，總花色苷含量最高，故選擇其為黑莓總花色苷提取的適宜提取溶劑。

2.1.2 黑莓中總花色苷的提取溫度選擇

提取溫度對總花色苷含量的影響見圖2。

圖2 提取溫度對總花色苷含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on anthocyanin content

由圖2結(jié)果可知，在相同條件下，隨著溫度的升高，總花色苷的含量相應(yīng)增加。當溫度達到55℃時，總花色苷含量達到最大值，這是因為升溫能提高總花色苷的溶解度和擴散速度，同時有助于細胞的破壞，從而使總花色苷類物質(zhì)易于從細胞內(nèi)釋出[24]。但是溫度過高會容易導(dǎo)致總花色苷被氧化，故選擇55℃為黑莓總花色苷提取的適宜溫度。

2.1.3 黑莓中總花色苷的提取料液比選擇

料液比對總花色苷含量的影響見圖3。

圖3 料液比對總花色苷含量的影響Fig.3 Effect of material to liquid ratio on anthocyanin content

由圖3結(jié)果可知，隨著提取溶劑的增多，總花色苷含量逐漸升高，當料液比達到1∶2（g/mL）時，總花色苷的含量最高。但是，當提取溶劑繼續(xù)增多時，總花色苷含量開始下降，故選擇料液比1∶2（g/mL）為黑莓花色苷的適宜料液比。

2.1.4 黑莓中總花色苷的提取時間選擇

提取時間對總花色苷含量的影響見圖4。

圖4 提取時間對總花色苷含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanin content

由圖4可知，在提取時間為40 min時，總花色苷含量最高，60 min次之，超過60 min時，總花色苷含量下降，故取提取時間40 min作為黑莓總花色苷的適宜提取時間。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將黑莓中總花色苷的含量作為響應(yīng)值，運用Box-Behnken中心組合試驗的原理，對黑莓中總花色苷的提取工藝方法進行處理優(yōu)化，試驗結(jié)果見表2及表3。

將表2驗數(shù)據(jù)用Design export 8.0.6軟件進行二元多次回歸擬合，得出二次多項回歸方程如下。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.2.2 響應(yīng)面試驗各因素交互結(jié)果

各因素交互作用的響應(yīng)面曲線見圖5。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面曲線Fig.5 Response surface curves of interaction factors

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值的三維曲線圖，構(gòu)成的響應(yīng)面圖坡面越陡峭，說明交互作用越明顯，越平緩，則交互作用越弱[25]。綜合以上，提取溶劑與提取溫度、提取溶劑與提取時間、提取溶劑和料液比、提取溫度和料液比交互作用顯著，提取溫度和提取時間、料液比和提取時間交互作用不明顯。

2.2.3 驗證試驗

經(jīng)Design Export 8.0.6軟件分析得到的黑莓中總花色苷的最佳提取工藝為提取溶劑1%鹽酸-甲醇、提取溫度 55 ℃、料液比 1∶4（g/mL）、提取時間 60 min，模型預(yù)測總花色苷含量值為0.246 8 mg/g，按照此條件，做驗證試驗3次，得到總花色苷平均值為0.233 5 mg/g，與模型預(yù)測值相差2.33%，綜上，應(yīng)用此模型優(yōu)化黑莓中總花色苷的提取工藝是可行的。

2.3 黑莓中總花色苷的抗氧化能力測定結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除測定結(jié)果

本試驗利用黑莓中的總花色苷粗提取液對DPPH自由基清除能力進行測定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 黑莓總花色苷粗提取液的DPPH自由基清除率Fig.6 DPPH free radical scavenging rate of blackberry anthocyanin crude extract

由圖6可知，5種不同濃度的黑莓總花色苷粗提取液都對DPPH自由基有一定的清除作用，且隨著總花色苷濃度的提高，其清除率也相應(yīng)增加，在總花色苷濃度為0.234 mg/mL時，其清除率達94.78%。

2.3.2 羥基自由基清除測定結(jié)果

羥基自由基是一種重要的活性氧，研究表明，人體多種疾病的發(fā)生與體內(nèi)自由基的氧化密切相關(guān)，本試驗利用黑莓總花色苷粗提取液對芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基進行清除力測定，結(jié)果如圖7所示。

圖7 黑莓總花色苷粗提取液對羥基自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of hydroxyl radical from anthocyanin crude extract in blackberry

如圖7所示，隨著總花色苷濃度的提高，羥基自由基清除率也相應(yīng)提高，在總花色苷濃度為0.234 mg/mL時，清除率為93.78%。

2.4 黑莓中總花色苷的抑菌能力測定

2.4.1 敏感性試驗

通過1.2.6.2的方法，獲得黑莓總花色苷粗提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的抑制作用結(jié)果，如圖8所示。

圖8 黑莓花色苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.8 Inhibitory effects of anthocyanins on E.coli and Staphylococcus aureus

抑菌圈的有無及大小可以反映是否有抑菌作用及大小，一般抑菌作用越強，抑菌圈的直徑越大。如圖8所示，與對照組對比，圖8a與圖8b中均產(chǎn)生了抑菌圈，表明黑莓總花色苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長都有一定的抑制作用，并且對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑小于對大腸桿菌的抑菌圈直徑，說明在同種條件下，黑莓總花色苷對大腸桿菌的抑制作用能力強于對金黃色葡萄球菌。

2.4.2 最小抑菌濃度試驗

通過1.2.6.3的方法，得到黑莓總花色苷粗提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度如表4所示。

表4 黑莓花色苷最小抑菌濃度測定結(jié)果Table 4 Determination of minimum inhibitory concentration of anthocyanins in blackberries

由表4所示，金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.445 mol/L，大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.222 mol/L。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取黑莓總花色苷的最優(yōu)條件為：提取溶劑1%HCl-甲醇、提取溫度55℃、提取時間 40 min、料液比 1∶4（g/mL），提取量為 0.233 5 mg/g。黑莓中總花色苷的DPPH自由基清除率為94.78%，羥基自由基清除率為93.78%，黑莓中總花色苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用，且對大腸桿菌的抑制能力強于對金黃色葡萄球菌。該方法可以為總花色苷的抗氧化活性和抑菌性提供一定的理論依據(jù)。