柚子皮多糖體外消化抗氧化活性的變化規(guī)律

萬劉靜，張利

（1.重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)工程系，重慶 408000；2.四川輕化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢 643002）

柚子是蕓香科喬木，具有清腸、助消化、利便、潤肺、健脾胃、補(bǔ)血的功效，也可促進(jìn)傷口愈合，對敗血癥有良好的療效[1]。柚子在世界各地均有種植，我國柚子總產(chǎn)量可達(dá)300萬噸，柚子皮約占柚子總量的40%[2]，經(jīng)食用后柚子皮因得不到充分利用造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。據(jù)研究報(bào)道柚子皮中活性物質(zhì)如多糖、膳食纖維、果膠、黃酮、香精油類等均具有多種生理活性[3]，但柚子皮的深加工還待進(jìn)一步擴(kuò)大。

柚子皮多糖是柚子皮主要成分之一，具有抗炎癥、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體血糖血脂等功效[4-5]。目前對柚子皮多糖的研究僅在提取方面，多糖提取方法主要有溶劑提取、酶法、超聲波輔助提取、化學(xué)法等[6-8]。其中超聲輔助提取法具有節(jié)時(shí)、節(jié)能且綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，酶法具有安全性高、產(chǎn)品質(zhì)量及純度較高、反應(yīng)條件溫和但成本高等特點(diǎn)。王瑩等[9]以柚皮為原料，利用纖維素酶與果膠酶輔助提取柚子皮多糖，結(jié)果表明在提取時(shí)間80 min、酶用量2.0%、提取溫度60℃、pH值為4.0的最佳工藝條件下柚子皮中多糖得率為8.26%，江飛鳳等[8]采用超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖，在液料比39∶1（mL/g），微波功率400 W，提取液pH 9.0，提取時(shí)間34 min的條件下制備得到的多糖得率為10.41%，張荔菲等[2]采用超聲輔助酶法，在加酶量1.73%、酶解時(shí)間1.19 h和超聲時(shí)間29.17 min的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)制備得到的柚子皮多糖的平均提取率為82.4%，得率為27.3%。但關(guān)于柚子皮多糖模擬體外消化的研究鮮有報(bào)道。

模擬體外消化模型是通過模擬胃腸消化后食物的消化特性，已經(jīng)成為體外模擬人體消化吸收的有效途徑和最新趨勢[10-11]。目前，有關(guān)柚子皮多糖在體外消化模型中的抗氧化活性評價(jià)鮮有報(bào)道，因此本研究采用超聲波輔助提取技術(shù)，通過對超聲溫度、超聲時(shí)間、復(fù)合酶添加量以及酶解時(shí)間為單因素，采用正交試驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，將最佳條件下制備得到的柚子多糖進(jìn)行體外模擬唾液、胃液以及小腸液消化試驗(yàn)，全面地評價(jià)柚子皮多糖在消化過程中的抗氧化活性變化情況，以期為柚子皮多糖的營養(yǎng)健康產(chǎn)品的研發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙田柚：市售，將其切成小塊進(jìn)行凍干，之后用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，取篩下物密封備用。胃蛋白酶（豬源，3 000 U/mg）、胰酶（豬胰腺，4 000 U/mg）、纖維素酶（400 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）：阿拉丁試劑有限公司；鄰菲羅啉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、無水乙醇、鹽酸、H2O2、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：西隴化工股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XA-1高速粉碎機(jī)：上海燁昌食品機(jī)械有限公司；EL204電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：國華（常州）儀器制造有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海耀特儀器設(shè)備有限公司；TGL-16GB高速離心機(jī)：上海安亭高速臺式離心機(jī)。

1.3 方法

柚子皮預(yù)處理（凍干后粉碎過80目，取篩下物）→超聲處理→離心（6 500 r/min離心8min）→濃縮→醇沉（4倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉過夜）→取醇沉物凍干后稱重即為柚子皮多糖質(zhì)量。

1.4 柚子皮多糖得率測定

式中：m1為柚子皮多糖的干重，g；m為柚子皮干重，g。

1.5 基本營養(yǎng)成分分析

蛋白質(zhì)測定：GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪測定：GB/T5009.9—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》；灰分測定：GB/T 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》；水分測定：GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》；膳食纖維測定：GB/T 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》。

1.6 超聲輔助酶法提取柚子皮多糖單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2 g柚子皮粉，分別設(shè)置超聲溫度（20、30、40、50、60℃）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、復(fù)合酶添加量（纖維素酶∶果膠酶質(zhì)量比為1∶1）（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、酶解時(shí)間（20、30、40、50、60 min），考察超聲溫度、超聲時(shí)間、復(fù)合酶添加量、酶解時(shí)間對柚子皮多糖得率的影響。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，試驗(yàn)自變量與水平見表1。

表1 試驗(yàn)自變量與水平Table 1 Codes and levels factors chosen for experiment

1.8 體外模擬胃腸液抗氧化活性研究

1.8.1 體外模擬消化液的收集與配制

1.8.1.1 唾液收集

漱口后，將初始唾液舍棄后開始進(jìn)行收集，收集周期為30 s，直至收集夠試驗(yàn)需求量，將收集到的唾液于6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心處理20 min，取上清液于-20℃保存。

1.8.1.2 模擬胃液的配制

準(zhǔn)確稱取10 g胃蛋白酶，加少量蒸餾水將其溶解后加入16.4 mL鹽酸并定容至1 000 mL，1 mol/L磷酸緩沖液調(diào)pH值至1.3后放置在4℃冰箱中保存。

1.8.1.3 模擬腸液的配制

準(zhǔn)確稱取6.8 g磷酸二氫鉀加少量蒸餾水將其溶解后用4%NaOH溶液并定容至1 000 mL，1 mol/L磷酸緩沖液調(diào)pH值至7.0；另準(zhǔn)確稱取10 g胰酶用100 mL蒸餾水將其充分溶解；兩液混合后加蒸餾水定容至1 000 mL后放置在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8.2 體外模擬消化系統(tǒng)方法

1.8.2.1 模擬口腔的消化

準(zhǔn)確吸取2 mL唾液和2 mL待測液（4.0 mg/mL）于6支試管中，封口混勻，于37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行消化試驗(yàn)，分別取消化 5、10、15、 20、30、60 min 后的消化液于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫（25℃）后于4 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.8.2.2 模擬胃液的消化

樣品溶液經(jīng)唾液消化15 min后分別加入預(yù)熱模擬胃液 4 mL，用1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至7.0，封口混勻，于37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行消化試驗(yàn)，分別消化5、10、15、60、120、240 min 后于沸水浴中滅酶 10 min，冷卻至室溫（25℃）于4000r/min離心10min，取上清液于-20℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.8.2.3 模擬腸液的消化

將模擬胃液消化后消化液調(diào)pH值至5.5后加入預(yù)熱的模擬腸液（反應(yīng)液與腸液體積比為10∶3），封口混勻于37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行消化試驗(yàn)，分別消化5、20、60、120、240、480 min 后于沸水浴中滅酶 10 min，冷卻至室溫（25℃）于4 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.8.3 體外模擬消化液的抗氧化活性研究

1.8.3.1 DPPH·清除率測定

準(zhǔn)確吸取 1mL 不同質(zhì)量濃度的（0、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2 mg/mL）待測液、加入 3 mL DPPH-無水乙醇溶液（0.2 mmol/L），混勻后于暗處反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后于517 nm處測吸光度值[13]。

DPPH·清除率見公式（2）。

式中：A1為樣品的吸光值；A為空白對照（蒸餾水）吸光值。

1.8.3.2 ·OH清除率測定

準(zhǔn)確吸取1 mL待測液，依次加入H2O2（0.5 mL，20 mmol/L）、鄰菲羅啉（1.0 mL，2.5 mmol/L）、硫酸亞鐵（1.0 mL，2.5 mmol/L），調(diào) pH 值為 7.0，室溫（25℃）靜置1h后于536nm處測吸光值[14]。·OH清除率公式如下。

式中：A2為樣品組吸光度值；A1為對照組吸光度值；A0為空白組（蒸餾水）的吸光度值。

1.8.3.3 O2-·清除率測定

準(zhǔn)確吸取4.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8.2）于試管中，置于25℃水浴中保持20 min，加0.4 mL待測液和0.08 mL鄰苯三酚（25 mmol/L，用10 mmol/L HCl配制），封口混勻后于325 nm波長處測定吸光值，之后每隔0.5 min記錄1次，共記錄4 min。10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液，蒸餾水代替樣液作為自氧化管[15]。 O2-·清除率見公式（4）、（5）。

式中：D1為樣品4 min記錄的吸光度值；D2為樣品0 min記錄的吸光度值；T=4 min；V1為自氧化管氧化速率，ΔA/min；V2為樣品管氧化速率，ΔA/min。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果用平均值（±s）表示，采用 Origin Pro 9.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助酶法提取柚子皮多糖單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲溫度對柚子皮多糖得率的影響

超聲溫度對柚子皮多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲溫度對柚子皮多糖得率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides in grapefruit peel

柚子皮多糖得率隨著超聲溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)超聲溫度為40℃時(shí)柚子皮多糖得率最高可達(dá)（24.44±0.53）%，這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)某暅囟仍龃罅顺暡ǖ目栈?yīng)，有利于多糖的溶出；繼續(xù)升高超聲溫度多糖得率略有下降，這可能由于過高的超聲溫度會破壞柚子皮多糖的分子結(jié)構(gòu)，多糖發(fā)生輕度水解，同時(shí)增加了溶液的黏稠度，不利于多糖的溶出，從而導(dǎo)致多糖得率下降[16-17]。因此，超聲溫度宜選擇為40℃。

2.1.2 超聲時(shí)間對柚子皮多糖得率的影響

超聲時(shí)間對柚子皮多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對柚子皮多糖得率的影響Fig.2 The effect of ultrasound time on the yield of grapefruit peel polysaccharides

當(dāng)超聲時(shí)間在20 min～40 min時(shí)柚子皮多糖得率逐漸增加，且在超聲時(shí)間為40 min時(shí)多糖得率最高為（25.43±0.59）%，繼續(xù)延長超聲時(shí)間柚子皮多糖得率無明顯變化且有略微下降，這可能是由于在超聲時(shí)間為40min時(shí)，使柚子皮中的多糖溶出最多，隨著超聲時(shí)間的延長導(dǎo)致柚子皮多糖得率逐漸降低，可能是因?yàn)殍肿悠ざ嗵且岩宰罡吆咳艹?，繼續(xù)延長超聲時(shí)間至60 min，柚子皮多糖細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，多糖發(fā)生降解，且溶劑中的其他物質(zhì)溶出過多使得多糖的溶出空間下降[18]。因此，從節(jié)能角度超聲時(shí)間宜選擇為40 min。

2.1.3 復(fù)合酶添加量對柚子皮多糖得率的影響

復(fù)合酶添加量對柚子皮多糖得率的影響見圖3。

圖3 復(fù)合酶添加量對柚子皮多糖得率的影響Fig.3 The effect of compound enzyme addition amount on the yield of grapefruit peel polysaccharide

當(dāng)復(fù)合酶添加量為0.5%～1.5%時(shí)柚子皮多糖得率逐漸增加，復(fù)合酶添加量為1.5%時(shí)柚子皮多糖得率達(dá)到最高為（24.87±0.36）%，這可能是因?yàn)槔w維素酶和果膠酶可使柚子皮中纖維素和果膠得細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，從而使柚子皮中的可溶性多糖溶出[2]；繼續(xù)增加酶比例，柚子皮多糖得率開始下降。這可能是因?yàn)殍肿悠ざ嗵前l(fā)生水解，生成了小分子的多糖、低聚糖或單糖，乙醇無法醇沉下來，從而使得可溶性膳食纖維得率下降[15]。因此復(fù)合酶添加量宜選擇為1.5%。

2.1.4 酶解時(shí)間對柚子皮多糖得率的影響

酶解時(shí)間對柚子皮多糖得率的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對柚子皮多糖得率的影響Fig.4 The effect of enzymolysis time on the yield of grapefruit peel polysaccharides

隨著酶解時(shí)間的增加，柚子皮多糖的得率呈先上升后下降趨勢，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)柚子皮多糖得率最高可達(dá)（25.77±0.89）%。這可能是因?yàn)槊傅淖饔脤?dǎo)致多糖分子鏈變短，使得更多的可溶性柚子皮多糖溶出，繼續(xù)延長酶解時(shí)間，柚子皮多糖的得率降低是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過高會使得多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，多糖發(fā)生降解，且柚子皮多糖具有溶脹性，溶劑增加導(dǎo)致膠質(zhì)增大，同時(shí)增加溶劑黏度導(dǎo)致得率下降[19]。因此酶解時(shí)間宜選擇為50 min。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化柚子皮多糖提取工藝

采用L9（34）正交表對柚子皮多糖得率進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平和分析結(jié)果與綜合指標(biāo)見表2。

由表2可知，主次因素順序?yàn)镃＞A＞B＞D，超聲輔助酶法提取柚子皮多糖的最佳工藝條件A1B2C2D2，即超聲溫度為30℃，超聲時(shí)間為40 min，復(fù)合酶添加量為1.5%，酶解時(shí)間為50 min，在最佳優(yōu)化條件下驗(yàn)證得出柚子皮多糖得率為（27.21±0.51）%，均高于其他工藝條件下各指標(biāo)值。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

2.3 模擬體外消化產(chǎn)物的抗氧化活性變化

2.3.1 體外模擬口腔唾液消化過程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性變化

柚子皮多糖模擬口腔唾液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的變化見圖5。

圖5 模擬口腔唾液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率變化規(guī)律Fig.5 Changes of DPPH·，·OH and O2-·scavenging ability during the digestion process of simulated oral saliva

由圖5可知柚子皮多糖模擬體外口腔唾液消化產(chǎn)物具有DPPH·、·OH和O2-·清除能力。在模擬消化5min時(shí)柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·清除率分別為（30.2±2.10）%、（50.7±1.12）%和（13.45±2.41）%。隨著消化時(shí)間的延長，DPPH·清除率和·OH清除率呈先上升后下降趨勢，在唾液消化20 min時(shí)，DPPH·、·OH和O2-·清除率分別達(dá)到最大為（58.65±2.67）%、（76.12±2.31）%和（16.73±2.20）%，推測原因可能與唾液里的消化酶作用時(shí)間有關(guān)，這與姚思雯等[10]的研究結(jié)果一致。但DPPH·清除率達(dá)到最高清除能力時(shí)低于1 mg/mL的VC溶液，·OH清除率低于3 mg/mL的VC溶液，O2-·清除率達(dá)到最高清除能力時(shí)遠(yuǎn)低于0.1 mg/mL的VC溶液。

2.3.2 體外模擬胃液消化過程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性變化

柚子皮多糖模擬胃液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的變化見圖6。

圖6 模擬胃液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率變化規(guī)律Fig.6 Changes of DPPH·、·OH and O2-·scavenging ability during simulated gastric juice digestion

圖6表明柚子皮多糖在模擬胃液中的消化產(chǎn)物具有DPPH·、·OH和O2-·清除能力。體外模擬胃液消化5 min時(shí)柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·和清除率分別為（45.23±2.20）%、（51.17±3.02）%和（20.12±2.02）%。DPPH·清除率隨著消化時(shí)間的延長先上升后下降，在模擬消化2h時(shí)達(dá)到最大清除率為（70.16±2.26）%。繼續(xù)延長消化時(shí)間，DPPH·清除率下降，這可能是因?yàn)殍肿悠ざ嗵窍笃浣Y(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化[10]。·OH清除率在消化1 h時(shí)間內(nèi)變化不大，在消化1 h時(shí)，清除率最大為（58.34±2.45）%。O2-·清除率在胃液消化1 h時(shí)清除率達(dá)到最大為（32.12±1.78）%。但DPPH·達(dá)到最高清除能力時(shí)低于2 mg/mL的VC溶液，·OH達(dá)到最高清除能力低于化2 mg/mL的VC溶液，O2-·達(dá)到最高清除能力遠(yuǎn)低于化0.1 mg/mL的VC溶液。

2.3.3 體外模擬腸液消化過程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性變化

柚子皮多糖模擬腸液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的變化見圖7。

圖7表明柚子皮多糖在模擬腸液中的消化產(chǎn)物具有·OH、O2-·和DPPH·清除能力。體外模擬腸液消化5 min時(shí)柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·清除率分別為（34.3±2.31）%、（37.6±2.22）%和（38.72±2.25）%。在小腸消化8 h時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到最大為（47.22±2.27）%，·OH清除率在模擬消化6 h時(shí)達(dá)到最大清除率（68.50±2.20）%，繼續(xù)延長消化時(shí)間，·OH 清除率下降，這可能是因?yàn)樵谀M腸液消化過程中，柚子皮多糖消化液可能收到了消化酶或者溫度等因素的影響，使得結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生了改變，從而引起了活性的變化[10]。O2·-清除率在小腸消化4 h時(shí)，清除率達(dá)到最大為（53.80±2.15）%。但DPPH·達(dá)到最高清除能力遠(yuǎn)低于0.1 mg/mL的VC溶液，·OH達(dá)到最高清除能力低于2 mg/mL的VC溶液，O2·-達(dá)到最高清除能力遠(yuǎn)低于0.1 mg/mL的VC溶液。VC溶液DPPH·、·OH和O2-·清除率見表 3。

圖7 模擬腸液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率變化規(guī)律Fig.7 Changes of DPPH·，·OH and O2-·clearing ability during the digestion of simulated intestinal juice

表3 VC溶液 DPPH·、·OH 和 O2-·清除率Table 3 The ability of VCsolution to remove DPPH·，·OH and O2-·radicals

3 結(jié)論

采用超聲輔助酶法提取柚子皮多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)進(jìn)行分析優(yōu)化，獲得的最佳工藝參數(shù)為：超聲溫度30℃、超聲時(shí)間40 min、復(fù)合酶添加量為1.5%、酶解時(shí)間50 min，在此條件下多糖得率為（27.21±0.51）%，在此條件下柚子皮多糖純度為68.12%，由體外模擬消化抗氧化試驗(yàn)可知柚子皮多糖消化產(chǎn)物均具有DPPH·、·OH和O2-·的清除能力。結(jié)果表明，柚子皮多糖消化產(chǎn)物在模擬口腔唾液20 min時(shí)，DPPH·、·OH和 O2-·清除能力分別達(dá)到最高為（58.65±2.67）%、（76.12 ±2.31）%和（16.73 ±2.20）%。在模擬胃液消化時(shí)，DPPH·清除率在消化2 h時(shí)最強(qiáng)為（70.16±2.26）%，·OH 和 O2-·清除能力在 1 h 時(shí)最強(qiáng)，分別達(dá)到（58.34±2.45）%和（32.12±1.78）%。 在模擬小腸消化時(shí)，DPPH·、·OH和O2-·清除率分別在消化8、6、4 h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)。在模擬小腸消化8 h時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到了（47.22±2.27）%、·OH 在消化 6 h時(shí)達(dá)到最大為（68.50±2.24）%，O2-·清除率在消化時(shí)間為 4 h時(shí)達(dá)到最大為（53.80±2.15）%。