復(fù)合益生菌對K99引起的犢牛腹瀉小腸結(jié)構(gòu)及腸膠質(zhì)細(xì)胞分泌亞硝基谷胱甘肽的影響

劉 彤，徐春生，祁鳳華，袁曉鳳，宋思佳

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

0 引言

腹瀉是犢牛常見的一種消化道疾病，常發(fā)生在犢牛三周齡左右，多發(fā)季節(jié)為初春、夏末和秋初，其危害犢牛的健康，治療不及時往往導(dǎo)致犢牛死亡率增加，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛的經(jīng)濟(jì)效益。生產(chǎn)中常用抗生素治療犢牛腹瀉，而抗生素易產(chǎn)生耐藥性，同時又會殺滅腸道有益菌群，引起腸道功能的紊亂。益生菌預(yù)防治療腹瀉是一種安全有效的選擇，益生菌可抑制部分腸道有害菌群，改善腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，達(dá)到治愈腹瀉的作用，且使用安全無殘留。

復(fù)合益生菌由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母菌按比例3∶3∶1組成。嗜酸乳桿菌可通過動物胃腸道中微生物的競爭排斥作用，幫助動物建立有益的宿主胃腸道微生物區(qū)系，促進(jìn)動物生長、預(yù)防動物疾病。殷金玲等[1]制成的免疫康可以從體液免疫、細(xì)胞免疫和單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)方面改善小鼠的機(jī)體免疫力?？莶菅挎邨U菌可以促進(jìn)動物采食、提高飼料利用率、改善動物胃腸道平衡、增加動物健康等。Lee等[2]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞的生長，增加小腸絨毛高度，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。布拉迪酵母菌可降低畜禽料重比、改善家禽生產(chǎn)性能、降低腹瀉的發(fā)生，可促進(jìn)畜禽腸道有益菌的增殖，產(chǎn)生乳酸從而降低腸道致病菌的含量，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)畜禽機(jī)體免疫因子的釋放和免疫器官的發(fā)育，進(jìn)一步增強(qiáng)畜禽機(jī)體免疫力[3]。

腸膠質(zhì)細(xì)胞（EGCs）是腸神經(jīng)膠質(zhì)系統(tǒng)的重要組成部分，其分泌的亞硝基谷胱甘肽（GSNO）具有較好地促進(jìn)腸黏膜屏障的作用。有關(guān)犢牛小腸EGC 分泌GSNO 的研究未見有報(bào)道，本試驗(yàn)應(yīng)用益生菌作用于K99 感染犢牛，探究益生菌及K99 對犢牛小腸GSNO 分泌的影響，為益生菌在犢牛腹瀉中的應(yīng)用提供參考資料，亦為EGC 的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物試驗(yàn)在新疆軍墾曙瑞奶牛場完成，選擇健康，胎次、胎齡相近的荷斯坦公犢牛22頭，體重約為40kg。

1.1.2 試驗(yàn)試劑無水乙醇、95%乙醇、二甲苯（天津化工有限公司）；石蠟、中性樹膠（上海萬輝儀器有限公司）；牛GSNO 試劑盒（上海酶連生物科技有限公司）；4%的多聚甲醛（賽國科技有限公司）；伊紅、蘇木精（北京索萊寶科技有限公司）。大腸桿菌K99（含菌量為1×109CFU·g-1）和復(fù)合益生菌（由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和布拉迪酵母菌按3∶3∶1 比例組成，含菌量為1×109CFU·mL-1）來自石河子大學(xué)動物科技學(xué)院。

1.1.3 試驗(yàn)儀器滅菌高壓鍋（江明市東華器械有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；萊卡石蠟切片機(jī)（RM2235）；載玻片、蓋玻片（天津化工科技有限公司）；KD-T電腦生物組織攤烤片機(jī)（浙江科迪儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

犢牛自出生后飼喂足量的初乳及鮮乳。將選擇的22 頭犢牛隨機(jī)分為3 組：對照組8 頭，常規(guī)飼喂，每日灌服10mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）；益生菌組6 頭，在試驗(yàn)開始第一天飼喂K99 10mL，之后每天飼喂復(fù)合益生菌；感染組8 頭，常規(guī)飼喂基礎(chǔ)上，每天灌服K99 10mL。試驗(yàn)期分別為7d、14d和21d，試驗(yàn)到期之時，于次日清晨晨飼前宰殺。

1.2.2 石蠟切片制作及病理觀察

犢牛頸動脈放血宰殺后，剖開腹腔分別取小腸各段組織樣2cm，PBS 清洗管腔后將組織樣置于中性甲醛固定液中12h，脫水，透明，包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察攝片。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法測定犢牛小腸內(nèi)GSNO的含量

1.2.3.1 樣品采集

分別從對照組、益生菌組、感染組隨機(jī)選取5頭牛，分離小腸，截取十二指腸、空腸和回腸段，沖洗掉腸道內(nèi)容物，于-20℃冰箱保存待測。

1.2.3.2 組織樣品處理

取小腸新鮮組織，用手工或勻漿器將其勻漿充分，4℃條件下3000r離心20min，仔細(xì)收集上清液用于分析。

1.2.3.3 ELISA方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50uL。

（2）加樣：分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。

（3）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100uL，空白孔除外。

（4）溫育：用封板膜封閉后置37℃溫育60min。

（5）配液：用蒸餾水將20 倍濃縮洗滌液稀釋20倍后備用。

（6）洗滌：每孔加滿洗滌液，靜置30s棄去，重復(fù)5次，拍干。

（7）顯色：加入顯色劑，37℃避光顯色15min。

（8）終止：每孔加終止液50uL，終止反應(yīng)。

（9）測定：以空白孔調(diào)零，450nm 下依序測量各孔吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止液后15min 內(nèi)進(jìn)行。

（10）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換：測量各孔的吸光度（OD 值）轉(zhuǎn)換成各孔的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用EXCEL 對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，用SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并做多重比較，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 犢牛小腸病理切片觀察

2.1.1 十二指腸

如圖1中A1～A3所示可知，對照組犢牛腸絨毛比較完整，無出血現(xiàn)象，有個別絨毛斷裂的情況出現(xiàn)；感染組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現(xiàn)象，如圖中箭頭所示為絨毛斷裂情況較多，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，排列比較緊實(shí)，結(jié)構(gòu)較為正常。

圖1 犢牛十二指腸病理切片圖Figure 1 Pathological sections of duodenum of calves

2.1.2 空腸

如圖2中B1～B3所示，對照組犢牛腸絨毛比較完整，有個別絨毛斷裂的情況出現(xiàn)；感染組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現(xiàn)象，箭頭所示為斷裂絨毛，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，排列較緊實(shí)，結(jié)構(gòu)較為正常。

圖2 犢?？漳c病理切片圖Figure 2 Pathological sections of jejunum of calves

2.1.3 回腸

如圖3 中C1~C3 所示可知，對照組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)比較完整；感染組犢牛腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現(xiàn)象，圖中箭頭標(biāo)示為絨毛斷裂情況，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，斷裂較少，排列較緊實(shí)，結(jié)構(gòu)正常。

圖3 犢?；啬c病理切片圖Figure 3 Pathological sections of ileum of calves

2.2 犢牛小腸內(nèi)GSNO的含量變化

由表1 所列可知，三組犢牛小腸中GSNO 的含量各有差異，其中十二指腸中GSNO 含量三組處理間無顯著差異；空腸中益生菌組GSNO 含量雖高于對照組，但兩者間無顯著差異（P＞0.05），對照組和益生菌組均顯著高于感染組（P＜0.05）；回腸中益生菌組GSNO 含量高于對照組，但兩者間無顯著差異（P＞0.05），對照組和益生菌組均極顯著高于感染組（P＜0.01）。

表1 犢牛小腸GSNO含量變化（單位：mmol·L-1）Table 1 Changes of GSNO content in small intestine of calves（unit:mmol· L-1）

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌及大腸桿菌K99 對犢牛小腸形態(tài)的影響

大腸桿菌是造成犢牛腹瀉的主要原因之一，已有研究證實(shí)犢牛從7 日齡起灌服大腸桿菌K99，其腹瀉率從30%上升到70%，犢牛的腹瀉率顯著提高[4]。張雪[5]研究得出飼糧添加枯草芽孢桿菌可以提高肉雞后期（22—42日齡）生長性能，且全期（1—42 日齡）效果不低于抗生素桿菌肽鋅。盧奇成等[6]的試驗(yàn)中，在犢牛早期（1—21d）飼糧中補(bǔ)充不同劑量的布拉氏酵母可以降低犢牛的腹瀉率，提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫力，減少犢牛的腹瀉。羅波文等[7]研究得出一定濃度的嗜酸乳桿菌可以提高細(xì)胞的抗氧化能力。邵青玲等[8]研究認(rèn)為腸絨毛高度是檢驗(yàn)小腸吸收能力的一個重要指標(biāo)。

從本試驗(yàn)HE 染色結(jié)果可以看出，對照組犢牛十二指腸、空腸及回腸腸絨毛完整，無出血現(xiàn)象；感染組腸絨毛有明顯的出血現(xiàn)象，絨毛斷裂、脫落，說明大腸桿菌K99在一定程度上會對犢牛腸道造成損傷，引起犢牛腹瀉；而益生菌組腸絨毛結(jié)構(gòu)較完整，無絨毛斷裂、脫落現(xiàn)象，表明益生菌一定程度上促進(jìn)腸道發(fā)育，對腸道有一定的保護(hù)作用。在十二指腸、空腸和回腸中，益生菌組的腸絨毛長度高于對照組和感染組，感染組的腸絨毛長度低于對照組，本試驗(yàn)中感染大腸桿菌K99可導(dǎo)致腸粘膜屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起犢牛腹瀉。而益生菌組腸絨毛較完整，結(jié)構(gòu)正常，說明復(fù)合益生菌對腸道有一定的保護(hù)作用。

3.2 復(fù)合益生菌及大腸桿菌K99 對犢牛小腸內(nèi)GSNO的影響

GSNO 是 EGCs 中的重要組成成分，而 EGCs 是腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，EGCs 的缺失，反映了腸上皮組織屏障的損害，不利于腸道的發(fā)育[9]。呂健[10]研究指出源自EGCs 的S-GSNO 是一種新的腸屏障功能誘導(dǎo)物。S-GSNO 對上皮屏障功能的調(diào)節(jié)，可能是通過對連接體周圍F 肌動蛋白的巰基亞硝基化和改變其表達(dá)來完成。本試驗(yàn)中，與對照組相比，益生菌組小腸中GSNO含量升高，而感染組小腸中GSNO 含量顯著降低，一定程度上反映復(fù)合益生菌具有促進(jìn)犢牛腸道發(fā)育的作用。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)中，犢牛感染大腸桿菌K99 導(dǎo)致腹瀉發(fā)生，而復(fù)合益生菌組小腸絨毛較完整，結(jié)構(gòu)正常，說明復(fù)合益生菌對腸道有一定的保護(hù)作用。并且感染組的GSNO 含量顯著下降，而益生菌組中含量增加，說明GSNO 可在一定程度上保護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整，抑制大腸桿菌K99的致病作用。

Referencesiversity

[1]殷金玲.免疫康的制備及增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)研究[D].長春：吉林大學(xué)，2013.Yin J L. Preparation of Mianyikang and its immunomodulato?ry activity experiment [D]. Changchun: Jinlin University，2013.（in Chinese）

[2]Lee M Y，Suh S J，Lee J H，et al.Expression patterns ofBa?cillus subtilisdiacylglycerol kinase gene induced by physio?logical stimuli [J].Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology Letters，2002，30（1）:15-20.

[3]Shams Z，Tahamtan Y，Pourbakhsh A，et al.Detection of en?terotoxigenic K99（F5）and F41 from fecal sample of calves by molecular and serological methods [J].Comparative Clini?cal Pathology，2012，21（4）:475-478.

[4]劉文慧，阿拉騰珠拉，馬露，等.丁酸鈉與絲蘭對大腸桿菌K99攻毒哺乳犢牛生長性能及血清抗氧化指標(biāo)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2020，32（9）：4177-4184.Liu W H，Alateng Z，Ma L，et al.Effects of sodium butyrate and yucca on growth performance and serum antioxidant indi?ces of sucking salves challenged with escherichia coli K99[J].Chinese Journal Of Animal Nutrition，2020，32（9）:4177-4184.（in Chinese）

[5]張雪，張珊，鐘光，等.枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能、腸道組織形態(tài)和盲腸微生物組成的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2020，32（11）：5195-5208.Zhang X，Zhang S，Zhong G，et al.Effects ofBacillus subtil?ison growth performance，intestinal morphology and cecal microbial composition of broilers [J].Chinese Journal of Ani?mal Nutrition，2020，32（11）:5195-5208.（in Chinese）

[6]盧奇成，吳妍妍，張文舉.布拉氏酵母菌對哺乳犢牛腹瀉率、血清免疫、抗氧化指標(biāo)及糞便微生物的影響[J].飼料工業(yè)，2020，41（9）：23-30.Lu Q C，Wu Y Y，Zhang W J. Effect ofSaccharomyces bou?lardiiondiarrhea rate，serum immunity，antioxidant index，and fecal microorganism in sucking calves[J].Feed Industry，2020，41（9）:23-30.（in Chinese）

[7]羅波文，鄒田德，陳麗玲，等.嗜酸乳桿菌對氧化應(yīng)激仔豬小腸上皮細(xì)胞抗氧化能力和緊密連接蛋白表達(dá)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2020，32（5）：2108-2115.Luo B W，Zou T D，Chen L L，et al. Effects ofLactobacillus acidophiluson antioxidative ability and expression of tight junction protein in intestinal epithelial cells of piglets under oxidative stress [J].Chinese Journal Of Animal Nutrition，2020，32（5）:2108-2115.（in Chinese）

[8]邵青玲，楊艷君，杜秀平.多糖對斷奶仔豬腸道菌群、絨毛形態(tài)和免疫功能的影響[J].中國飼料，2020（8）：46-50.Shao Q L，Yang Y J，Du X P. Effects of polysaccharides on intestinal flora，villi morphology and immunity in weaned pig?lets[J].China Feed，2020（8）:46-50.（in Chinese）

[9]肖衛(wèi)東，彭科，楊樺.腸膠質(zhì)細(xì)胞在腸穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用機(jī)制與研究展望[J].世界華人消化雜志，2016，24（25）：3657-3665.Xiao W D，Peng K，Yang H.Enteric glial cells:An emerging key player in intestinal homeostasis modulation under physio?logical and pathological conditions [J].World Chinese Journal of Digestology，2016，24（25）:3657-3665.（in Chinese）

[10]呂健.腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008（19）：2904-2907.Lyu J.Research progress of enteric glia cells[J].Medical Re?capitulate，2008，14（19）:2904-2907.（in Chinese）