腦膜瘤組織中H3K27me3的表達(dá)及臨床意義

崔 黎，崔 瑩，張紅燕，陳奎生

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052；2.鄭州衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州 450052)

腦膜瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤之一，是起源于蛛網(wǎng)膜腦膜上皮細(xì)胞的顱內(nèi)和椎管內(nèi)腫瘤[1]，腦膜瘤占全部腦腫瘤的19.2%～30.0%[2-3]。2016年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將腦膜瘤分為3級(jí)，腦膜瘤組織學(xué)亞型15種。不同WHO級(jí)別和組織學(xué)亞型的腦膜瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和侵襲能力不同，術(shù)后治療方式也不同，因此，明確診斷腦膜瘤WHO級(jí)別和組織學(xué)亞型對(duì)臨床治療以及患者預(yù)后評(píng)估具有重要意義。組蛋白H3在體內(nèi)存在單甲基化(me1)、二甲基化(me2)及三甲基化(me3)3種形式，其N-末端賴氨酸殘基K27是主要的甲基化修飾位點(diǎn)，其甲基化的程度可影響相應(yīng)區(qū)域DNA的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄的作用[4]，組蛋白H3K27me3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，H3K27me3在正常的腦膜上皮不表達(dá)，而在腦膜瘤組織中表達(dá)[5]，部分腦膜瘤組織中H3K27me3表達(dá)缺失，H3K27me3表達(dá)缺失的腦膜瘤患者復(fù)發(fā)率較高[6]。為進(jìn)一步探討H3K27me3是否能夠作為評(píng)估腦膜瘤級(jí)別及預(yù)后的指標(biāo)，本研究檢測(cè)了腦膜瘤組織中H3K27me3的表達(dá)，并分析了其與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年5月至2019年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的140例腦膜瘤患者的腫瘤標(biāo)本為研究對(duì)象。140例患者中男81例，女59例；年齡≥40歲者74例，<40歲者66例；腦膜瘤WHO分級(jí)Ⅰ級(jí)62例，Ⅱ級(jí)47例，Ⅲ級(jí)31例；WHOⅠ級(jí)患者腦膜瘤組織學(xué)亞型：腦膜上皮細(xì)胞型14例，纖維型17例，過(guò)渡細(xì)胞(混合)型21例，砂礫體型3例，血管瘤型1例，微囊型2例，分泌型1例，富于淋巴漿細(xì)胞型1例，化生型2例；WHOⅡ級(jí)患者腦膜瘤組織學(xué)亞型：脊索樣型4例，透明細(xì)胞型1例，非典型性腦膜瘤42例；WHO Ⅲ級(jí)患者腦膜瘤組織學(xué)亞型：乳頭型2例，橫紋肌樣型1例，間變型腦膜瘤28例?；颊咝g(shù)后病理診斷明確,未進(jìn)行放射治療和化學(xué)治療。標(biāo)本離體0.5～1.0 h固定于中性多聚甲醛液體中，用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE) 染色和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑兔抗人H3K27me3單克隆抗體和免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白表達(dá)石蠟切片用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，滴加體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氧，室溫下孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，每次5 min。將切片放入有枸櫞酸鹽抗原的修復(fù)盒，高壓鍋中高壓20 min，自然冷卻后再用PBS洗滌3次，每次5 min；滴加體積分?jǐn)?shù)10%兔血清(PBS稀釋)后繼續(xù)孵育30 min，棄血清，滴加H3K27me3單克隆抗體(1100)，空白對(duì)照滴加PBS代替一抗，切片仍置于濕盒內(nèi)，4 ℃冰箱保存過(guò)夜；取出濕盒，滴加生物素化二抗工作液孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育 10 min，PBS液洗滌3次,每次5 min。滴加3，3-二氨基聯(lián)苯胺底物工作液于切片，顯微鏡下控制顯色，自來(lái)水終止顯色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，封片后顯微鏡下觀察。

1.4 腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白表達(dá)的結(jié)果判定H3K27me3蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，呈淺黃色至深褐色顆粒。參照文獻(xiàn)[5]，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，根據(jù)著色強(qiáng)度和著色數(shù)量綜合判斷H3K27me3蛋白的表達(dá)。著色強(qiáng)度：細(xì)胞核未染色為0分，細(xì)胞核可見淡黃色顆粒為1分，細(xì)胞核可見棕黃色顆粒為2分，細(xì)胞核可見深褐色顆粒為3分；著色數(shù)量：靶組織中著色細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%≤靶組織中著色細(xì)胞數(shù)<25%為1分，25%≤靶組織中著色細(xì)胞數(shù)<50%為2分，靶組織中著色細(xì)胞數(shù)≥50%為3分。根據(jù)著色強(qiáng)度評(píng)分與著色數(shù)量評(píng)分的乘積判斷H3K27me3蛋白表達(dá)強(qiáng)度，0～2分為陰性表達(dá)，≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。用已知的H3K27me3陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)鞘瘤組織作陽(yáng)性對(duì)照；用已知的H3K27me3陰性表達(dá)的腦膜上皮組織作陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示，兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)；多樣本率的比較采用行列表資料的χ2檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同WHO分級(jí)腦膜瘤組織學(xué)特征及H3K27me3蛋白表達(dá)結(jié)果見圖1、圖2和表1。WHOⅠ級(jí)腦膜瘤組織中細(xì)胞密度中等，未見核分裂；WHOⅡ級(jí)腦膜瘤組織中細(xì)胞密度稍增大，可見明確的腦組織侵犯；WHO Ⅲ 級(jí)腦膜瘤組織中細(xì)胞密度明顯增多，核分裂易見。腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白表達(dá)強(qiáng)度隨著WHO級(jí)別升高而逐漸降低。腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨著WHO級(jí)別升高逐漸降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：WHOⅠ級(jí)腦膜瘤；B:WHOⅡ級(jí)腦膜瘤；C：WHO Ⅲ級(jí)腦膜瘤。

A、D：WHOⅠ級(jí)腦膜瘤組織；B、E：WHOⅡ級(jí)腦膜瘤組織；C、F：WHO Ⅲ級(jí)腦膜瘤組織；A～C:×200；D～F:×100。

表1 不同WHO分級(jí)腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白表達(dá)

2.2 腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白表達(dá)與腦膜瘤患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白的表達(dá)與腦膜瘤患者的年齡、性別及腫瘤的組織學(xué)亞型均無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 腦膜瘤組織中H3K27me3蛋白表達(dá)與腦膜瘤患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

3 討論

腦膜瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，腦膜瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)率、患者是否需要聯(lián)合放射治療以及預(yù)后情況均與腦膜瘤的級(jí)別相關(guān)[7]，但腦膜瘤的組織學(xué)亞型種類多且分級(jí)復(fù)雜，因此，尋找協(xié)助腦膜瘤分級(jí)的分子標(biāo)志物是臨床病理診斷工作中的重中之重。研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是由表觀遺傳異常導(dǎo)致基因的DNA序列不發(fā)生變化的條件下，基因功能發(fā)生可遺傳的變化，引起表達(dá)失常所致，表觀遺傳學(xué)包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)和非編碼RNA的調(diào)控[8]。核心組蛋白在翻譯完成后其N端尾區(qū)發(fā)生的甲基化、乙?；傲姿峄墙M蛋白修飾，這些修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)從而影響復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及DNA修復(fù)等一系列重要的生理過(guò)程，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá)。組蛋白H3K27me3的修飾是表觀遺傳中重要的基因沉默標(biāo)志，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與增殖之間的平衡，其表達(dá)失衡可導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化失控，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-10]。研究表明,組蛋白H3K27me3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[11]。多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)可產(chǎn)生H3K27me3 ，PRC2由Zeste基因增強(qiáng)人類同源物2(enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)和胚胎干細(xì)胞抑制蛋白(suppressor of Zeste,SUZ12)及胚胎外胚層發(fā)育蛋白(embryonic ectoderm development,EED)3部分關(guān)鍵亞基構(gòu)成，EZH2在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，EZH2與H3K27me3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[12]；EZH2表達(dá)過(guò)高或者功能改變均會(huì)導(dǎo)致H3K27me3的表達(dá)失衡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，H3K27me3在肝癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中存在異常表達(dá)，且是重要的獨(dú)立預(yù)后評(píng)估因子[14]；H3K27me3在神經(jīng)鞘瘤中呈高表達(dá)，而在惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤中表達(dá)缺失[15]。本研究通過(guò)檢測(cè)H3K27me3蛋白在腦膜瘤組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，H3K27me3蛋白在腦膜瘤組織中呈高表達(dá)，隨著腦膜瘤WHO級(jí)別的升高，其表達(dá)逐漸降低；H3K27me3蛋白在腦膜瘤組織中的表達(dá)與腦膜瘤患者的性別、年齡及各種組織學(xué)亞型無(wú)相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，H3K27me3蛋白可以作為腦膜瘤的WHO分級(jí)的一個(gè)重要免疫組織化學(xué)指標(biāo)，為臨床上腦膜瘤術(shù)后是否進(jìn)行放射治療提供理論依據(jù)。隨著對(duì)H3K27me3研究的深入，其有望成為腦膜瘤靶向治療的新靶點(diǎn)。