復(fù)方心脈佳對巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子caspase-1和白細(xì)胞介素-1β表達(dá)的影響及其機(jī)制

劉 剛，崔朝初，盧 娜，馮超麗，劉 博，萬光瑞，王現(xiàn)偉

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種常見的慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重時可引起冠狀動脈性心臟病、腦梗死和外周血管病，給患者及家屬帶來嚴(yán)重的不良影響[1-3]。AS的主要病理特征為血管壁脂質(zhì)沉積和炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥反應(yīng)可加劇AS斑塊損害或破裂，從而增加心血管不良事件的發(fā)生[2,4]。AS的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，隨著研究的不斷深入，近年來炎癥免疫學(xué)說在AS發(fā)病中的作用得到了學(xué)術(shù)界的普遍重視[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，特異性地抑制白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子可顯著減少AS及其并發(fā)癥的發(fā)生[7-9]。復(fù)方心脈佳是由功能性紅曲米、葛根、牡丹皮等10余味中藥和天然提取物組成，具有抗炎、抗氧化等功效，可逆轉(zhuǎn)AS[10-13]。目前，關(guān)于復(fù)方心脈佳在AS中的確切抗炎機(jī)制尚不清楚。因此，本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和尼日利亞菌素(nigericin)刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7和人單核巨噬細(xì)胞THP-1構(gòu)建體外炎癥細(xì)胞模型，探討復(fù)方心脈佳對巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子caspase-1和IL-1β表達(dá)的影響，旨在為復(fù)方心脈佳在臨床AS治療中的應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7和人單核巨噬細(xì)胞THP-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，液氮冷凍保存。

1.2 試劑與儀器復(fù)方心脈佳為本實驗室自制(批號141206、150122、150214)[14]；LPS、尼日利亞菌素(nigericin)和拂波醇酯(phorbol myristate acetate,PMA)購自美國Sigma公司，高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibico公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)蛋白酶抑制劑、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒和細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自北京索萊寶生物科技有限公司，TRIzol試劑購自美國Invirogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green染料購自日本Takara公司，增強型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒、胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，caspase-1抗體、IL-1β抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)二抗和山羊抗小鼠偶聯(lián)HRP二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二氧化碳(carbon dio-xide,CO2)培養(yǎng)箱購自美國Eppendorf公司，酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，NanoDrop 2000超微量分光光度計購自美國Thermo公司，蛋白化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國GE公司，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀器購自美國Roche公司，電泳儀和電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)將液氮保存的RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋中至完全融化，取RAW264.7細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS高糖DMEM，THP-1細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和適度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基。待RAW264.7細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底部面積80%時應(yīng)用胰蛋白酶消化傳代。THP-1細(xì)胞培養(yǎng)1周后1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，培養(yǎng)基重懸后傳代。取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 復(fù)方心脈佳藥物制備準(zhǔn)確稱量20 mg復(fù)方心脈佳粉末，37 ℃下溶于10 mL超純水中，保溫孵育10 min；取上清，過0.22 μm濾膜，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 CCK-8檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，按每孔1×104個細(xì)胞接種至96孔板中，隨機(jī)分為對照組和體積分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%復(fù)方心脈佳組，分別滴加體積分?jǐn)?shù)0、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%和 20.0%的復(fù)方心脈佳，每組設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)空白對照組，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h；使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率 =(復(fù)方心脈佳組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%。實驗重復(fù)3次，取均值。當(dāng)細(xì)胞存活率低于90%，認(rèn)為該藥物濃度對細(xì)胞具有毒性，取無細(xì)胞毒性的復(fù)方心脈佳濃度用于后續(xù)實驗。

1.3.4 細(xì)胞分組及處理取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，均勻接種至6孔板中，將細(xì)胞分為對照組、LPS組、低劑量復(fù)方心脈佳組、中劑量復(fù)方心脈佳組和高劑量復(fù)方心脈佳組；對照組細(xì)胞未做任何藥物處理，LPS組細(xì)胞應(yīng)用1 mg·L-1LPS孵育4 h；低劑量復(fù)方心脈佳組、中劑量復(fù)方心脈佳組和高劑量復(fù)方心脈佳組細(xì)胞分別用體積分?jǐn)?shù) 1.0%、2.5%、5.0%復(fù)方心脈佳孵育12 h，隨后加入1 mg·L-1LPS孵育4 h。收集各組細(xì)胞，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取對?shù)生長期THP-1細(xì)胞，均勻接種至6孔板中，加入100 μg·L-1PMA孵育48 h，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、聯(lián)合刺激組、低劑量復(fù)方心脈佳組、中劑量復(fù)方心脈佳組和高劑量復(fù)方心脈佳組。對照組細(xì)胞未做任何藥物處理；聯(lián)合刺激組細(xì)胞給予1 mg·L-1LPS孵育4 h后，加入10 μmol·L-1nigericin孵育1 h；低劑量復(fù)方心脈佳組、中劑量復(fù)方心脈佳組和高劑量復(fù)方心脈佳組分別用體積分?jǐn)?shù)1.0%、2.5%、5.0%復(fù)方心脈佳預(yù)孵育12 h后，加入1 mg·L-1LPS孵育4 h，然后加入10 μmol·L-1nigericin孵育1 h；收集等體積各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 Western blot法檢測RAW264.7細(xì)胞中IL-1β前體和caspase-1前體蛋白的表達(dá)取各組RAW264.7細(xì)胞，PBS沖洗3遍，每組加入 200 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心15 min，取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量；取20 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯膜，加入體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶，室溫孵育1 h，加入caspase-1抗體(11 000)、IL-1β抗體(11 000)和GAPDH抗體(11 000)4 ℃ 過夜孵育；洗膜后加入對應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記二抗(18 000)室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液，暗室中曝光、顯影，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，Image J圖像分析軟件分析各條帶灰度值，caspase-1和IL-1β相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白(GAPDH)灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.6 qRT-PCR檢測RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體和核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)mRNA表達(dá)取對照組、LPS組和高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明書，應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，NanoDrop分光光度計檢測總RNA濃度和純度，按照說明書步驟反轉(zhuǎn)錄總RNA，qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體和NF-κB mRNA的Ct值。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共42個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參。caspase-1前體上游引物序列為5′-ACAAGGCACGGGACCTATG-3′，下游引物序列為5′-TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG-3′；IL-1β前體上游引物序列為5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′，下游引物序列為5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′；NF-κB上游引物序列為5′-GGAGGCATGTTCGGTAGTGG-3′，下游引物序列為5′-CCCTGCGTTGGATTTCGTG-3′；β-actin上游引物序列為5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG- 3′，下游引物序列為5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。采用2-ΔΔCt法計算IL-1β前體、caspase-1前體和NF-κB mRNA相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.7 Western blot法檢測THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和caspase-1蛋白的表達(dá)取各組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清，置于EP管中，300×g離心5 min，取上清置于新的EP管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%脫氧膽酸鈉，震蕩混勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%三氯乙酸100 μL，4 ℃過夜沉淀；4 ℃下14 000 r·min-1離心15 min，棄上清，冰丙酮洗滌3次，14 000 r·min-1離心15 min，棄丙酮，加入上樣緩沖液溶解蛋白，煮沸5 min后，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行Western blot檢測，方法同“1.3.5”項。

若繼受取得說成立，依其定義必須從他人處通過讓渡取得權(quán)利，這里所指的他人，只能是善意取得關(guān)系人中的原權(quán)利人或無權(quán)處分人，權(quán)利只能從原權(quán)利人或無權(quán)處分人處讓渡。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方心脈佳對RAW264.7細(xì)胞活性的影響對照組與0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%復(fù)方心脈佳組的細(xì)胞存活率分別為(100.00±2.43)%、(102.25±2.76)%、(102.05±2.76)%、(100.63±3.32)%、(94.17±2.05)%、(83.62±3.46)%、(79.44±9.60)%。復(fù)方心脈佳體積分?jǐn)?shù)低于5%時，細(xì)胞存活率>90%，對細(xì)胞無明顯毒性。

2.2 5組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖1和表1。對照組和LPS組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組和LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于低、中劑量復(fù)方心脈佳組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于低劑量復(fù)方心脈佳組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LPS組和低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于低、中劑量復(fù)方心脈佳組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于低劑量復(fù)方心脈佳組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1：對照組；2：LPS組；3：低劑量復(fù)方心脈佳組；4：中劑量復(fù)方心脈佳組；5：高劑量復(fù)方心脈佳組。

表1 5組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體和IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量比較

2.3 3組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體和NF-κB mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表2。LPS組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β 前體以及NF-κB mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體以及NF-κB mRNA相對表達(dá)量顯著低于LPS組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體和NF-κB mRNA相對表達(dá)量比較

2.4 5組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖2和表3。聯(lián)合刺激組和低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相對表達(dá)量顯著低于聯(lián)合刺激組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量復(fù)方心脈佳組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相對表達(dá)量顯著低于低、中劑量復(fù)方心脈佳組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低劑量復(fù)方心脈佳組與中劑量復(fù)方心脈佳組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1：對照組；2、3：聯(lián)合刺激組；4：低劑量復(fù)方心脈佳組；5：中劑量復(fù)方心脈佳組；6：高劑量復(fù)方心脈佳組。

表3 5組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中caspase-1和IL-1β蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

近年來，我國在心血管系統(tǒng)疾病的研究和防治中取得了巨大的進(jìn)步，但心血管疾病發(fā)病率仍較高，其中因AS導(dǎo)致的死亡人數(shù)約占我國居民疾病死亡的40%，給社會和人民帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。最近的一項流行病學(xué)研究表明，2020年全球近20億人患頸動脈粥樣硬化，患病率呈逐年上升趨勢[15]。因此，深入研究AS的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)安全有效的治療藥物對于AS的防治至關(guān)重要。2017年，卡納單抗抗血栓臨床研究組(the canakinumab anti-inflammatory thrombosis outcomes study,CANTOS)首次發(fā)現(xiàn)，以IL-1β為靶點的卡納單抗可顯著減少因AS引起的相關(guān)不良心血管事件的發(fā)生率[7]，提出炎癥因子IL-1β直接參與了AS的發(fā)展進(jìn)程，這為AS炎癥免疫假說提供了有力證據(jù)。因此，開發(fā)以IL-1β為靶點的藥物或可成為未來預(yù)防和治療AS新的突破。

復(fù)方心脈佳主要由功能性紅曲米、葛根和牡丹皮等10余味中藥和天然提取物構(gòu)成，具有“急治血瘀、慢治脂瘀”的功效。研究顯示，心脈佳可降低由過氧化氫引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、IL-1等炎癥因子表達(dá)，增加超氧化物歧化酶表達(dá)和一氧化氮水平[12]。另有動物實驗研究顯示，心脈佳可顯著降低AS動物模型血液中總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白以及ICAM-1和VCAM-1水平，顯著減少頸動脈斑塊面積，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能以及血流動力學(xué)指標(biāo)[10,13,16]。這些研究結(jié)果說明，復(fù)方心脈佳可從抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等多個方面緩解AS的發(fā)展進(jìn)程，但其具體的作用機(jī)制還不清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)，AS斑塊中除了含有脂質(zhì)外，還存在著多種炎癥細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞[17-18]。巨噬細(xì)胞在受到LPS、nigericin和氧化低密度脂蛋白等活化劑的刺激下，可激活NF-κB信號通路，顯著上調(diào)IL-1β前體和caspase-1前體等炎癥相關(guān)因子表達(dá)；caspase-1前體可被切割成活化的caspase-1并促進(jìn)成熟IL-1β等炎癥因子的釋放，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝紊亂，加重AS的發(fā)展[9,19-20]。因此，本研究以巨噬細(xì)胞RAW264.7作為研究對象，應(yīng)用LPS刺激方法體外構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，觀察復(fù)方心脈佳對RAW264.7細(xì)胞中caspase-1和IL-1β 表達(dá)的影響，從抗炎方面探討復(fù)方心脈佳治療AS的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方心脈佳干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h后，當(dāng)其濃度低于5.0%時，細(xì)胞存活率> 90%，說明復(fù)方心脈佳體積分?jǐn)?shù)低于5.0%對細(xì)胞無明顯毒性，故本研究采用體積分?jǐn)?shù)1.0%、2.5%和5.0%作為藥物的工作濃度用于后續(xù)實驗研究。本研究結(jié)果顯示，低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組和LPS組，LPS組和低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組，低、中、高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于LPS組，高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于低、中劑量復(fù)方心脈佳組，中劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體蛋白相對表達(dá)量顯著低于低劑量復(fù)方心脈佳組。LPS組RAW264.7細(xì)胞中caspase-1前體、IL-1β前體mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組；高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞caspase-1前體、IL-1β前體mRNA相對表達(dá)量顯著低于LPS組和對照組。這一結(jié)果說明復(fù)方心脈佳可顯著降低LPS誘導(dǎo)的IL-1β前體、caspase-1前體mRNA和蛋白表達(dá)水平，且呈劑量依賴，提示復(fù)方心脈佳可通過降低巨噬細(xì)胞中IL-1β前體、caspase-1前體mRNA和蛋白表達(dá)水平，抑制巨噬細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，從而逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的AS。

有研究顯示，LPS可激活巨噬細(xì)胞中NF-κB信號通路，增加IL-1β前體和caspase-1前體的轉(zhuǎn)錄水平[21]，因此推測，復(fù)方心脈佳可能通過調(diào)控NF-κB信號通路減少caspase-1和IL-1β mRNA的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，LPS組RAW264.7細(xì)胞中NF-κB mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組，高劑量復(fù)方心脈佳組RAW264.7細(xì)胞NF-κB mRNA相對表達(dá)量顯著低于LPS組，證實復(fù)方心脈佳可降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB mRNA的表達(dá)，提示復(fù)方心脈佳可能是通過抑制NF-κB信號通路減少巨噬細(xì)胞中caspase-1和IL-1β水平。成熟的IL-1β可通過旁分泌或自分泌的方式釋放至組織間隙或血液中發(fā)揮其重要的生物學(xué)效應(yīng)，由于RAW264.7細(xì)胞存在缺陷無法產(chǎn)生和分泌成熟的IL-1β和caspase-1，因此，本研究進(jìn)一步檢測了復(fù)方心脈佳對巨噬細(xì)胞THP-1培養(yǎng)上清液中IL-1β和caspase-1蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，復(fù)方心脈佳可顯著降低LPS和nigericin誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和caspase-1蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。這說明復(fù)方心脈佳還可以通過抑制巨噬細(xì)胞釋放IL-1β和caspase-1來減輕炎癥反應(yīng)。

綜述所述，復(fù)方心脈佳通過抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB信號通路，抑制caspase-1前體和IL-1β前體的mRNA和蛋白表達(dá)，減少caspase-1和IL-1β的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮防治AS的作用。但復(fù)方心脈佳治療AS可能具有多靶點和多條調(diào)節(jié)途徑，如抗氧化及脂質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究僅僅從該藥的抗炎癥反應(yīng)機(jī)制做了研究，對于復(fù)方心脈佳治療AS的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。