腎嫌色細胞癌ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

李冰瀅， 劉 暢， 李 楓， 張慶梅， 羅 彬， 葛盈盈， 農(nóng)蔚霞， 陳 芳， 肖紹文， 謝小薰

腎嫌色細胞癌(chromophobe renal cell carcinoma,CRCC)是一種來源于集合管上皮暗細胞的腎腫瘤，于1985年由Thoenes等[1]首次報道。CRCC多發(fā)于50～60歲，臨床上無特殊病狀和特征，部分患者可出現(xiàn)血尿或腫瘤壓迫癥狀，僅有少數(shù)病例呈彌漫生長并侵及腎周脂肪組織和腎靜脈[2-3]。有研究顯示，CRCC的5年疾病無復(fù)發(fā)生存率(relapse-free survival,RFS)為89.3%，癌癥特異性生存率(cancer-specific survival,CSS)為93%，并指出性別、TNM分期以及肉瘤樣分化是預(yù)測CRCC預(yù)后的重要指標[4]?？偠灾?，CRCC是一種具有特殊形態(tài)、少見、低度惡性的腎細胞癌，相對于其他腎腫瘤而言，單純CRCC預(yù)后較為樂觀。非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，主要分為短非編碼RNA和長非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)兩類，其在基因的轉(zhuǎn)錄中起著重要的調(diào)控作用。lncRNA是長度>200 nt(核苷酸)的RNA分子，它不僅參與了機體正常的生物學(xué)功能，同時也與許多腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展具有關(guān)聯(lián)[5-7]。除lncRNA外，近年來微小RNA(micro RNA,miRNA)發(fā)現(xiàn)對腫瘤研究的發(fā)展也起到了重要作用，其是一類長約22 nt(核苷酸)的保守非編碼單鏈小RNA，最早于1993年由Lee等[8]在秀麗蟲中發(fā)現(xiàn)。當miRNA與信使RNA(messenger RNA,mRNA)結(jié)合時，可通過結(jié)合靶基因上的miRNA反應(yīng)元件(microRNA response element,MRE)降解或沉默其靶基因從而抑制mRNA的翻譯[9]，其不僅參與細胞生長、衰老和凋亡的調(diào)節(jié)，而且與生命過程的各階段密切相關(guān)[10-11]。但目前關(guān)于lncRNA與miRNA在CRCC中的研究仍鮮見。值得注意的是，近年有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA具有“Spone”的功能，即與miRNA聯(lián)系并調(diào)節(jié)miRNA的靶基因，這是一個更為復(fù)雜且精細的分子調(diào)控機制，稱之為“內(nèi)源競爭性RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”。2011年P(guān)ier等首次提出ceRNA的假說，其核心認為ceRNA可通過MRE競爭結(jié)合相同的miRNA以調(diào)節(jié)靶基因的表達水平，即lncRNA可以作為ceRNA競爭性地結(jié)合miRNA以調(diào)控mRNA[12]。目前學(xué)者們已在腎透明細胞癌和腎癌中建立了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使我們能更好地了解疾病的發(fā)生、發(fā)展機制，探討治療疾病的潛在靶點[13-14]。本研究使用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中的CRCC轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，并篩選出在CRCC發(fā)生、發(fā)展過程中差異表達(differential expression,DE)的lncRNA、mRNA和miRNA，進一步構(gòu)建CRCC的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出與CRCC預(yù)后相關(guān)的mRNA、lnRNA和miRNA，為CRCC的診斷和預(yù)后提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1TCGA數(shù)據(jù)收集 登陸TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov/)，使用GDC API下載CRCC樣本(65例)和正常腎樣本(24例)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取樣本的miRNA和mRNA數(shù)據(jù)。應(yīng)用genecode v22 gtf文件提取lncRNA和蛋白編碼基因(polycomb group,PCG)。對獲取的數(shù)據(jù)進一步處理，根據(jù)每個mRNA、lncRNA和miRNA在樣本的表達水平去除低豐度的mRNA、lncRNA和miRNA，篩選條件：表達水平>1。

1.2DEmRNA、DEmiRNA和DElncRNA篩選 使用R軟件包DESeq2進行差異分析。差異表達基因的篩選條件：錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.05，差異倍數(shù)的對數(shù)絕對值(log2|fold change|,log2|FC|)>2。根據(jù)該條件對選出的89例CRCC和正常腎樣本的數(shù)據(jù)信息進行篩選，結(jié)果獲得3 679個DElncRNA、297個DEmiRNA、5 914個DEmRNA，進一步使用R語言繪制DERNAs的熱圖和火山圖。

1.3ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用miRDB(http://mirdb.org)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測DEmiRNA靶向的mRNA作為靶mRNA集。應(yīng)用mircode數(shù)據(jù)庫預(yù)測DEmiRNA的靶l(wèi)ncRNA作為靶l(wèi)ncRNA集。以基于上述篩選出來互作的DERNAs，構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA互作的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 3.6.1繪制ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4生存分析和富集分析 下載Liu等[15]文章中的65例CRCC樣本信息，將這些臨床信息對應(yīng)至ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA、miRNA和mRNA，得到表達于臨床樣本的DERNAs。通過單因素分析計算兩組的預(yù)后差異并選取關(guān)鍵節(jié)點，并對這些關(guān)鍵節(jié)點進行Kaplan-Meier曲線分析，篩選與CRCC生存預(yù)后相關(guān)的基因。應(yīng)用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建篩選出基因的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，并進行GO與KEGG富集分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DElncRNA、DEmiRNA和DEmRNA篩選結(jié)果 在3 679個DElncRNA中上調(diào)表達1 604個，下調(diào)表達2 075個；297個DEmiRNA中上調(diào)表達136個，下調(diào)表達161個；5 914個DEmRNA中上調(diào)表達2 531個，下調(diào)表達3 383個，見圖1。進一步將所得DERNAs進行雙向聚類分析，所得相應(yīng)熱圖見圖2。

橙色點表示高表達差異基因，綠色點表示低表達差異基因，藍色點則表示無差異基因

橫坐標為組織樣本(藍色為腫瘤組織樣本，紫色為正常組織樣本)；縱坐標為DERNAs(紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào))

2.2ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建情況 選取在CRCC中上調(diào)表達的DEmiRNA與其相對應(yīng)的下調(diào)的DEmRNA和DElncRNA構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括95個DEmiRNA、268個DEmRNA和737個DElncRNA。選取在CRCC中下調(diào)表達的DEmiRNA與其對應(yīng)的上調(diào)的DEmRNA和DElncRNA構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括85個DEmiRNA、234個DEmRNA和924個DElncRNA。最終構(gòu)建出2個初始ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并借助cytoscape將其可視化。見圖3，4。

藍色點表示DEmRNA，綠色點表示DElncRNA，紅色點表示DEmiRNA

藍色點表示DEmRNA，綠色點表示DElncRNA，紅色點表示DEmiRNA

2.3ceRNA中DElncRNA、DEmiRNA、DEmRNA與CRCC預(yù)后相關(guān)性分析結(jié)果 應(yīng)用Kaplan-Meier分析進一步探討ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的DERNAs與CRCC預(yù)后的相關(guān)性。首先進行DEmiRNA預(yù)后分析，結(jié)果顯示僅miR-26b-5p與CRCC預(yù)后具有相關(guān)性，miR-26b-5p高表達患者預(yù)后較好(P=0.11)，見圖5。從初始的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中抽出miR-26b-5p相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖6)，發(fā)現(xiàn)miR-26b-5p靶向的DEmRNA共有19個，Kaplan-Meier分析顯示僅DEPDC1、E2F7、SLC7A11與CRCC預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，見圖7。miR-26b-5p靶向的DElncRNA有21個，但均未發(fā)現(xiàn)其與CRCC預(yù)后相關(guān)(P>0.05)。

2.4CRCC預(yù)后相關(guān)DEmRNA的PPI和富集分析結(jié)果 基于STRING 11.0數(shù)據(jù)庫的PPI分析結(jié)果顯示，DEPDC1、E2F7、SLC7A11和TOP2A、SLC3A2、E2F8、E2F1、TP53之間存在潛在的蛋白互作聯(lián)系。進一步對其進行富集分析，GO富集分析結(jié)果顯示，這些基因主要參與DNA損傷反應(yīng)、p53介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致的細胞組織與啟動子特異結(jié)合等，見圖8。KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些基因功能主要富集于鐵死亡、Cell cycle，MicroRNAs in cancer以及Pathways in cancer等信號通路上，見圖9。

圖5 has-miR-26-5p的Kaplan-Meier生存曲線圖

藍色為miRNA，紅色為lncRNA，綠色為mRNA

圖7 DEPDC1、E2F7和SLC7A11的Kaplan-Meier生存曲線圖

?分子功能(molecular function,MF)結(jié)果，其中紅色代表近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合；藍色代表離子反轉(zhuǎn)運活性；綠色代表中性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運活性；黃色代表DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子活性；紫色代表核酸結(jié)合。?生物過程(biological process,BP)結(jié)果，其中紅色代表有絲分裂DNA完整性檢查點；藍色代表DNA損傷反應(yīng)、p53-me類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；綠色代表DNA內(nèi)復(fù)制的正調(diào)控；黃色代表轉(zhuǎn)錄負調(diào)控參與有絲分裂細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換；紫色代表絨毛膜滋養(yǎng)層細胞分化。圖中基因?qū)?yīng)的顏色代表該基因參與的功能。?細胞組分(cellular component,CC)結(jié)果，紅色代表轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體。

紅色代表鐵死亡；藍色代表cell cycle；綠色代表MicroRNAs in cancer；黃色代表Pathways in cancer。圖中基因?qū)?yīng)的顏色代表該基因參與的信號通路

3 討論

3.1腎癌是男性腫瘤中的第6大常見腫瘤，是女性腫瘤第10大常見腫瘤[16]。在世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)分級中腎癌共有12種亞型[17]，CRCC占腎癌的5%，且是腎癌中預(yù)后最好的一種亞型。研究[3]顯示，不同性別、病變位置(左側(cè)或右側(cè))的CRCC發(fā)病情況無顯著差異，TNM分期多為Ⅰ～Ⅱ期，但CRCC發(fā)生轉(zhuǎn)移后更多地表現(xiàn)為肉瘤樣變，預(yù)后比透明細胞癌更差。Geramizadeh等[18]在對123例CRCC的術(shù)后隨訪中發(fā)現(xiàn)僅20例(16%)患者發(fā)生疾病進展(局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡)。因此，尋找潛在的生物學(xué)靶點來防止CRCC的轉(zhuǎn)移意義重大。

3.2隨著測序技術(shù)的不斷成熟，研究者可以從海量的數(shù)據(jù)庫中篩選出影響疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子，從而更好地闡明其分子機制。ceRNA假說提出了一個編碼RNA與非編碼RNA之間更為復(fù)雜精細的調(diào)控，為目前研究RNA之間的相互作用提供了新思路，而miRNA、lncRNA和mRNA之間的相互作用具有重要的生物學(xué)意義。本研究中，我們篩選出TCGA數(shù)據(jù)庫中CRCC組織和正常腎組織中的DEmRNA、DElncRNA和DEmiRNA，并構(gòu)建了兩個初始ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：其一為上調(diào)DEmiRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括95個DEmiRNA、268個DEmRNA和737個DElncRNA；另一為下調(diào)DEmiRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括85個DEmiRNA、234個DEmRNA和924個DElncRNA。進一步的Kaplan-Meier分析顯示，其中1個miRNA(miR-26b-5p)和3個mRNA(DEPDC1、SLC7A11和E2F7)與CRCC預(yù)后相關(guān)，且它們之間存在潛在的靶向關(guān)系。miRNA在腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用，但在CRCC方面，miRNA的相關(guān)研究卻鮮有。Zhang等[19]通過實驗驗證了miR-26b通過直接與DEPDC1的3′-UTR結(jié)合而抑制DEPDC1的表達，兩者之間存在靶向關(guān)系。但目前仍沒有研究對miR-26b-5p與E2F7之間的靶向關(guān)系進行驗證，需進一步開展研究。miR-26b-5p在多種癌癥中屬于抗腫瘤基因，且miR-26b-5p的過表達可阻斷細胞G1/S期，抑制膀胱癌、肝細胞癌、乳腺癌的增殖[20]。

3.3E2F7是轉(zhuǎn)錄因子家族中E2F家族抑制子中的一員，有研究[21]表明E2F7參與細胞周期的調(diào)控，其上調(diào)可造成細胞周期停滯，下調(diào)則可促進細胞周期的進展。目前仍未發(fā)現(xiàn)E2F7在CRCC中的生物學(xué)功能的文獻報道，本研究結(jié)果提示E2F7可以作為CRCC預(yù)后的潛在預(yù)測因子。DEPDC1在多種人類癌癥中顯著增高，其可能是不同腫瘤疾病中的促腫瘤因子，如膀胱癌中DEPDC1上調(diào)表達，對癌細胞的生長至關(guān)重要[22]。本研究結(jié)果也表明DEPDC1在CRCC中高表達，并且是其潛在的預(yù)后預(yù)測因子。SLC7A11廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞和巨噬細胞等細胞中。SLC7A11基因缺失會擾亂細胞的生長、代謝甚至導(dǎo)致癌變。有研究[23]表明SLC7A11的高表達與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并與疾病預(yù)后不良相關(guān)。相似的，本研究也發(fā)現(xiàn)SLC7A11在CRCC中高表達，并與CRCC預(yù)后具有關(guān)聯(lián)。

3.4本研究PPI網(wǎng)絡(luò)共發(fā)現(xiàn)8個蛋白互作基因，分別為TOP2A、E2F7、E2F1、E2F8、TP53、SLC7A11、SLC3A2和DEPDC1，進一步的富集分析結(jié)果顯示，E2F1和TP53參與細胞周期調(diào)控，可抑制細胞增殖，并作用于Pathways in cancer、Cell cycle和MicroRNAs in cancer通路上。另外有研究[24]顯示，SLC3A2在各類腎腫瘤，包括CRCC組織中呈高表達，這為尋找新的CRCC生物學(xué)標志物提供了線索。

綜上所述，本研究構(gòu)建了CRCC的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩出與CRCC預(yù)后具有關(guān)聯(lián)的RNA分子，其中miRNA-26b-5p在CRCC中呈低表達，而E2F7、DEPDC1和SLC7A11呈高表達，為CRCC的診斷、治療以及預(yù)后提供了潛在的生物學(xué)靶點。