WISP-3/CNN6與Caspase-8共結(jié)合在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制

黃曉梅　王康瑋　唐萬(wàn)娜　趙祝香　趙子文　魏樹(shù)全

【摘要】目的 探討Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6（WISP-3/CNN6）與半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）共結(jié)合在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用與可能機(jī)制。方法 利用小干擾RNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)對(duì)人肺上皮Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6基因的沉默或過(guò)表達(dá)，分別將低表達(dá)或過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的Beas-2B細(xì)胞置高氧（95%O2和5%CO2）或空氣中處理0、24、48 h，通過(guò)蛋白免疫印跡法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Caspase-3及活性片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved 多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的表達(dá)量及Caspase-8活性，通過(guò)免疫共聚焦和免疫共沉淀檢測(cè)WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白相互作用。結(jié)果 高氧刺激48 h，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)量均比0 h時(shí)增加（P均< 0.017），且Caspase-8的活性增高（P < 0.05）;過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量比0 h時(shí)減少（P < 0.017），cleaved Caspase-3和cleaved PARP的蛋白表達(dá)量在24 h時(shí)比0 h時(shí)升高、在48 h時(shí)比24 h時(shí)下降（P均< 0.017）。高氧刺激下，Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6蛋白和Caspase-8蛋白結(jié)合減少。結(jié)論 WISP-3/CCN6通過(guò)Caspase途徑參與高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其作用可能通過(guò)與Caspase-8蛋白結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】高氧;細(xì)胞凋亡;Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6;半胱氨酸蛋白酶途徑;急性肺損傷

【Abstract】Objective To investigate the role and the molecular mechanism of WISP-3/CCN6 binding with Caspase-8 in the hyperoxia-induced apoptosis of the lung epithelial cells. Methods The silencing and overexpression of WISP-3/CCN6 in the human lung bronchial epithelial cells （Beas-2B） were performed by plasmid transfection and siRNA. The Beas-2B cells with silencing or overexpressing WISP-3/CCN6 were maintained in hyperoxia （95%O2 and 5%CO2） or air for 0， 24 and 48 h， respectively. The expression levels of key proteins of Caspase signaling pathway （Caspase-8， Caspase-3， cleaved Caspase-8， cleaved Caspase-3 and PARP） were detected with Western blot and the activity of Caspase-8 was determined with flow cytometry. The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was analyzed by immunoconfocal and immunocoprecipitation. Results After 48-h hyperoxia treatment， the expression levels of cleaved Caspase-8， cleaved Caspase-3 and cleaved PARP in the Beas-2B cells with silencing WISP-3/CCN6 were significantly up-regulated （all P < 0.017） and the activity of Caspase-8 was remarkably increased compared with those at 0 h （P < 0.05）. The expression of cleaved Caspase-8 in the Beas-2B cells with overexpressing WISP-3/CCN6 was significantly down-regulated than that at 0 h （P < 0.017）. The expression levels of cleaved Caspase-3 and cleaved PARP at 24 h were significantly up-regulated than those at 0 h， whereas the expression levels at 48 h were significantly down-regulated compared with those at 24 h （all P < 0.017）. The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was signigficantly decreased in the Beas-2B cells after hyperoxia. Conclusion WISP-3/CCN6 participates in the regulation of hyperoxia-induced apoptosis of lung epithelial cells via the Caspase signaling pathway， probably by binding with Caspase-8 protein.

【Key words】Hyperoxia;Cell apoptosis;WISP-3/CCN6;Caspase pathway;Acute lung injury

高濃度氧療對(duì)危重癥患者的危害已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外呼吸危重癥領(lǐng)域的關(guān)注，但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究仍然較少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)高氧可以引起肺上皮細(xì)胞凋亡[1]。有研究顯示，Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6（WISP-3/CCN6）作為一種信號(hào)傳導(dǎo)因子在高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡中具有保護(hù)性作用，但其機(jī)制仍然不清楚。本文將在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究WISP-3/CCN6在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為未來(lái)防治高氧性肺損傷提供基礎(chǔ)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

人肺上皮細(xì)胞株（Beas-2B細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

二、高氧模型的建立

參考本課題組前期研究建立高氧模型[2-3]。

三、WISP-3/CCN6質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染

通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和小干擾RNA（siRNA）技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6基因的過(guò)表達(dá)及沉默，選用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，詳細(xì)步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

四、蛋白免疫印跡檢測(cè)

分別把沉默或過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6基因的Beas-2B細(xì)胞置于高氧中培養(yǎng)0、24、48 h，以空氣環(huán)境為對(duì)照（control）。提取各組細(xì)胞蛋白，蛋白免疫印跡法檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶（Caspase）途徑凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Caspase-3和活化片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3以及cleaved-多聚ADP核糖聚合酶（PARP）表達(dá)量。WISP-3/CCN6、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。采用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Caspase-8蛋白活性

采用美國(guó)BD公司的Caspase-8蛋白活性檢測(cè)試劑盒和BD公司的流式細(xì)胞儀檢測(cè)空氣環(huán)境及高氧刺激0、48 h時(shí)WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8的活性。

六、免疫熒光-激光共聚焦試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6在高氧刺激肺上皮細(xì)胞的作用方式，利用免疫熒光-激光共聚焦和免疫共沉淀法檢測(cè)WISP-3/CCN6蛋白與細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白的結(jié)合變化。其中免疫熒光-激光共聚焦采用美國(guó)Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體、美國(guó)Santa Cruz公司的抗Caspase-8抗體和德國(guó)Leica公司的激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。步驟為：①24孔板中放置圓形玻片，將Beas-2B細(xì)胞接種于玻片上;②放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞密度約50% ～ 60%，把細(xì)胞分別置于高氧（95%O2和5%CO2）和空氣中處理24 h;

③用鑷子輕輕取出玻片置于操作臺(tái)上，趁玻片未干時(shí)向玻片滴入磷酸鹽緩沖液（PBS），然后負(fù)壓吸干，洗滌3次;④在玻璃片上滴入4%多聚甲醛，固定30 min后，負(fù)壓吸干，固定細(xì)胞;⑤滴入0.5% Triton-X-100覆蓋整個(gè)玻片，室溫放置1 h（細(xì)胞膜打孔）;⑥然后用PBS洗滌3次，滴入5%牛血清白蛋白，室溫放置2 h;⑦把玻片放回24孔板，加入1∶100的一抗（Caspase-8抗體和WISP-3/CCN6抗體）4 ℃過(guò)夜孵育;⑧次日取出，用PBS洗滌3次后加入熒光抗體（紅色為Caspase-8抗體，綠色為WISP-3/CCN6抗體），避光孵育10 min;⑨取出玻片，自然晾干后倒扣于載玻片上，周?chē)弥讣子头膺叀Ｗ詈笤诩す夤簿劢癸@微鏡下觀察空氣環(huán)境和高氧環(huán)境下Caspase-8與WISP-3/CCN6的結(jié)合情況。

七、免疫共沉淀試驗(yàn)

采用美國(guó)Abcam公司的細(xì)胞裂解液RIPA緩沖液、美國(guó)Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體進(jìn)行檢測(cè)。步驟為：①把Beas-2B細(xì)胞接種于6孔板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞密度約50% ～ 60%，把細(xì)胞分別置于高氧（95%O2和5%CO2）、空氣中處理4 h;②取出細(xì)胞置于冰上，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞2次后，加入細(xì)胞裂解液RIPA buffer（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min;③4℃，18 000轉(zhuǎn)/分離心30 min后，把上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管，取少量樣品以備蛋白免疫印跡分析;④在樣品中加入1 μl的興趣蛋白抗體，4℃搖床緩慢搖晃孵育過(guò)夜;⑤次日取10 μl的Protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3000轉(zhuǎn)/分離心3 min;⑥將預(yù)處理過(guò)的10 μl

的Protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的樣品中，4℃搖床緩慢搖晃孵育2 ～ 4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠充分偶聯(lián);⑦4℃，3000轉(zhuǎn)/分

離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底，將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗滌3 ～ 4次，洗滌時(shí)用手指輕彈;⑧最后加入15 μl的2倍SDS 上樣緩沖液，沸水煮5 min，免疫印跡檢測(cè)目的蛋白。本研究的興趣蛋白為WISP-3/CCN6，目的蛋白為Caspase-8。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0分析結(jié)果，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用方差分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較采用Bonferroni法，即P < 0.05/3 = 0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、環(huán)境對(duì)WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白的影響

無(wú)論是高氧刺激還是空氣環(huán)境下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化（P均> 0.05）?？諝猸h(huán)境下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)變化（P均> 0.05）。高氧刺激下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量在24 h和48 h升高（總體比較F = 13.590、P = 0.006，與0 h比較P均< 0.017），cleaved Caspase-3僅在48 h表達(dá)上調(diào)（總體比較F = 86.24、 P < 0.001，與0 h和24 h比較P均< 0.017）。WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved PARP表達(dá)量在高氧刺激（F = 728.90，P < 0.001）及空氣環(huán)境（F = 39.19，P < 0.001）24 h和48 h均升高（與0 h比較，P均< 0.017），高氧刺激下cleaved PARP表達(dá)量在WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中升高趨勢(shì)較空氣環(huán)境更明顯（與24 h比較，P < 0.017），見(jiàn)圖1A ～ C。高氧刺激48 h下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中的Caspase-8活性比0 h時(shí)升高，見(jiàn)圖1D。

二、環(huán)境對(duì)WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白的影響

無(wú)論是高氧刺激還是空氣環(huán)境下，WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化（P均> 0.05）?？諝猸h(huán)境下，WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量在48 h時(shí)升高（總體比較F = 202.55、 P < 0.001，與0 h和24 h比較P均< 0.017，cleaved PARP蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高（總體比較F = 155.53、P < 0.001，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均<0.017）。高氧刺激下，WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8隨時(shí)間延長(zhǎng)而均減少（總體比較F = 21.79、P = 0.002，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均< 0.017），cleaved Caspase-3 （F = 105.10，P < 0.001）和cleaved PARP（F = 320.00，P < 0.001）蛋白表達(dá)量在24 h比0 h升高，48 h時(shí)均下降（3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均< 0.017），見(jiàn)圖2。

三、環(huán)境對(duì)肺上皮細(xì)胞中WISP-3/CCN6和Caspase-8蛋白的相互作用影響

與空氣環(huán)境相比，高氧刺激24 h時(shí)Beas-2B細(xì)胞WISP-3/CCN6與細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-8結(jié)合的熒光信號(hào)減少（圖3A）。把WISP-3/CCN6作為感興趣蛋白，與空氣環(huán)境相比，高氧刺激24 h時(shí)與其結(jié)合的Caspase-8蛋白減少（P < 0.001，圖3B）。

討論

高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是異常復(fù)雜的，其確切的機(jī)制仍然不清楚。在凋亡通路中，Caspase家族發(fā)揮重要的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效應(yīng)因子，控制下游的凋亡共同通路，它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆的階段，因此Caspase-3及其活性片段也被稱(chēng)為凋亡的生物標(biāo)志物[4]。

本研究中，肺上皮細(xì)胞中WISP-3/CCN6沉默后再接受高氧刺激48 h，細(xì)胞的cleaved Caspase-3活性片段表達(dá)增加，表明沉默WISP-3/CCN6可以促進(jìn)Caspase-3的激活。Caspase-3是凋亡外源性和內(nèi)源性途徑的共同效應(yīng)蛋白，它的激活可以進(jìn)一步活化下游的凋亡因子，如PARP[5-7]。多種凋亡刺激因子可以啟動(dòng)Caspase-3活化，Caspase-3蛋白酶原被切割成有活性的片段cleaved Caspase-3，活化的Caspase-3又進(jìn)一步作用于下游的不同底物，導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6與Caspase-3的關(guān)系，本研究在Beas-2B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6，與

0 h時(shí)相比，過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的細(xì)胞在高氧刺激下，Caspase-3蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)量先升高，后下降。因此，WISP-3/CCN6可能控制著Caspase-3的活化，進(jìn)而調(diào)控高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。

要驗(yàn)證WISP-3/CCN6通過(guò)Caspase-3調(diào)控細(xì)胞凋亡，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6與其下游凋亡效應(yīng)因子的關(guān)系。本研究中Beas-2B細(xì)胞沉默和過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6基因后再接受高氧刺激48 h，結(jié)果顯示沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞中 cleaved PARP蛋白表達(dá)量增加，而WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的肺上皮細(xì)胞中的cleaved PARP蛋白表達(dá)量先升高，后隨時(shí)間延長(zhǎng)下降，也就是說(shuō)，WISP-3/CCN6可能影響著PARP的活化。WISP-3/CCN6對(duì)肺上皮細(xì)胞中Caspase-3和PARP活化的影響是同向的。那么在Caspase-3上游，凋亡啟動(dòng)蛋白是否也與WISP-3/CCN6有聯(lián)系呢？

Caspase-3和Caspase-8同屬于Caspase家族，在細(xì)胞凋亡的外源性途徑中，Caspase-8是關(guān)鍵的啟動(dòng)型蛋白，Caspase-8通過(guò)誘導(dǎo)接近模式活化后可以作用于底物Caspase-3引起下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起凋亡。在正常情況下，Caspase-8存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞接受死亡刺激之后，Caspase-8可以與FADD結(jié)合，從而與細(xì)胞膜上的死亡受體發(fā)生間接結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合體，從而把死亡信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化到細(xì)胞漿中去[8-9]。本研究在Beas-2B細(xì)胞中沉默和過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6后再接受高氧刺激24、48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與0 h時(shí)相比，沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量增加，而WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的肺上皮細(xì)胞中的cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量降低，也就是說(shuō)，WISP-3/CCN6也可能影響著Caspase-8的活化。進(jìn)一步研究顯示，沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞在高氧刺激48 h時(shí)Caspase-8的活性增強(qiáng)，證實(shí)WISP-5/CCN6與Caspase-8活化有關(guān)。

在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞模型當(dāng)中，WISP-3/CCN6與凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3以及其上游的凋亡啟動(dòng)蛋白Caspase-8和下游的凋亡效應(yīng)蛋白PARP均有聯(lián)系。由此推測(cè)，WISP-3/CCN6可能通過(guò)Caspase通路參與了高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。那么WISP-3/CCN6的作用靶點(diǎn)在哪里？根據(jù)Caspase凋亡通路的原理，推測(cè)其作用靶點(diǎn)在Caspase-8或其上游。為此，本研究通過(guò)蛋白的相互作用了解WISP-3/CCN6與Caspase-8的關(guān)系。目前檢測(cè)蛋白間的相互作用常用的方法是免疫共聚焦和免疫共沉淀。該研究采用的細(xì)胞仍然是Beas-2B細(xì)胞。高氧處理24 h后，經(jīng)細(xì)胞打孔和免疫熒光染色，并通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，與空氣環(huán)境相比，高氧刺激24 h后，WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結(jié)合熒光信號(hào)減少。同時(shí)，我們把WISP-3/CCN6設(shè)為興趣蛋白，用免疫共沉淀的方法把WISP-3/CCN6及其相結(jié)合的蛋白沉淀，進(jìn)一步用蛋白免疫印跡法檢測(cè)WISP-3/CCN6與Caspase-8的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空氣環(huán)境相比，高氧刺激使WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結(jié)合減少。這兩項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果表明，高氧環(huán)境中，肺上皮細(xì)胞中的WISP-3/CCN6蛋白可能通過(guò)某種機(jī)制大量丟失，其丟失導(dǎo)致WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白結(jié)合減少，進(jìn)而導(dǎo)致Caspase-8激活，Caspase-8的活化引起其下游的一系列凋亡因子級(jí)聯(lián)激活，啟動(dòng)經(jīng)典的Caspase凋亡途徑，使肺上皮細(xì)胞大量凋亡。

綜上所述，WISP-3/CCN6可能是高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要調(diào)控蛋白，也可能是防治高氧性肺損傷的一個(gè)潛在的作用靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。然而高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是異常復(fù)雜的，WISP-3/CCN6僅為其中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，是否存在其他的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 王康瑋，黃艷，何樺，黃曉梅，巫培連，胡超，魏樹(shù)全. Flotillin-2在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用. 廣東醫(yī)學(xué)，2017，38（5）：675-678.

[2] 魏樹(shù)全，王康瑋，黃曉梅，唐萬(wàn)娜，趙祝香，趙子文. Wnt-1信號(hào)通路蛋白-3（WISP-3）在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用.廣州醫(yī)藥，2018，49（6）：6-12.

[3] Wei S， Wang K， Zhao Z， Huang X， Tang W， Zhao Z. WISP-3/CCN6 inhibits apoptosis by regulating caspase pathway after hyperoxia in lung epithelial cells. Gene， 2018， 673：82-87.

[4] McIlwain DR， Berger T， Mak TW. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol， 2015， 7（4）：a026716.

[5] Fodor R?， Georgescu AM， Grigorescu BL， Cioc AD， Veres M， Cotoi OS， Fodor P， Copotoiu SM， Azamfirei L. Caspase 3 expression and plasma level of Fas ligand as apoptosis biomarkers in inflammatory endotoxemic lung injury. Rom J Morphol Embryol， 2016， 57（3）：951-957.

[6] Agarwal A， Mahfouz RZ， Sharma RK， Sarkar O， Mangrola D， Mathur PP. Potential biological role of poly （ADP-ribose） polymerase （PARP） in male gametes. Reprod Biol Endocrinol， 2009， 7：143.

[7] Luo H， Liang H， Chen J， Xu Y， Chen Y， Xu L， Yun L， Liu J， Yang H， Liu L， Peng J， Liu Z， Tang L， Chen W， Tang H. Hydroquinone induces TK6 cell growth arrest and apoptosis through PARP-1/p53 regulatory pathway. Environ Toxicol， 2017， 32（9）：2163-2171.

[8] Larsen BD， S?rensen CS. The caspase-activated DNase： apop-tosis and beyond. FEBS J， 2017， 284（8）：1160-1170.

[9] Tummers B， Green DR. Caspase-8： regulating life and death. Immunol Rev， 2017， 277（1）：76-89.

（收稿日期：2019-12-19）

（本文編輯：林燕薇）