水解酶對(duì)杜仲葉黃酮提取的影響研究

◎陳書(shū)明

（1.三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院；2.三門(mén)峽市生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南三門(mén)峽 472000）

杜仲（Eucommia ulmoides），是杜仲科落葉喬木，是我國(guó)特有的名貴中藥材[1]。2000多年以來(lái)，人們都是以杜仲皮入藥[2]，因受產(chǎn)量限制杜仲皮在市場(chǎng)上供不應(yīng)求。研究證實(shí)杜仲葉與杜仲皮有相似功效，2005年，杜仲葉被載入《中華人民共和國(guó)藥典》,2018年納入藥食兩用物質(zhì)管理。杜仲葉主要藥理作用為降血壓、降血脂、降血糖、抗炎抗病毒、抗疲勞、強(qiáng)筋健骨、抗衰老等[3]。杜仲葉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括：VB1、β-胡蘿卜素，17種游離氨基酸，鍺、硒等15種微量元素，大約10%—20%的蛋白質(zhì)。杜仲葉還含有豐富的活性成分，包括黃酮類、多糖類及杜仲橡膠等。目前，人們對(duì)杜仲葉的開(kāi)發(fā)利用進(jìn)行了研究，并研制出一系列杜仲葉新產(chǎn)品，其中利用杜仲葉制成的杜仲茶受到了廣泛的歡迎[4]。常見(jiàn)的杜仲速溶茶提取方法有水提法和有機(jī)溶劑法。這兩種方法的缺陷分別是杜仲葉中的活性成分溶出有限和提取物中存在有機(jī)溶劑殘留[5]。

酶制劑作為生物制劑，具有天然、綠色、安全、無(wú)污染等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品加工的各個(gè)領(lǐng)域。纖維素酶能將杜仲葉片的纖維素分解，提高營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分的溶出。另外，杜仲葉中的粗蛋白只有1%-2%是可溶于水的，常規(guī)提取方法蛋白質(zhì)的溶出率低，外用蛋白酶能將杜仲葉中蛋白質(zhì)解轉(zhuǎn)化為氨基酸，不僅可以提高杜仲葉及杜仲葉蛋白的利用價(jià)值，還可以提高和改善水浸出物品質(zhì)。果膠酶主要作用于杜仲葉細(xì)胞壁中的果膠，通過(guò)果膠水解，從而破壞由蛋白質(zhì)、茶多酚和果膠等碳水化合物物形成的懸浮顆粒的穩(wěn)定體系，使得茶湯澄清。單寧酶可以水解單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸和葡萄糖?？梢苑乐箚螌幏肿又泻械姆恿u基在多酚氧化酶存在的條件下被氧化，生成具有顏色的鄰醌，這種物質(zhì)會(huì)加深產(chǎn)品的色澤[6]。另外現(xiàn)有研究表明，添加外源單寧酶可以在一定程度上降低產(chǎn)品苦澀味，從而提高產(chǎn)品的鮮醇度[7]。目前，人們對(duì)單一酶制劑在杜仲葉提取中的作用進(jìn)行了研究，但復(fù)合酶制劑對(duì)杜仲葉的作用效果鮮少報(bào)道。

本研究以杜仲葉為原料，通過(guò)水解酶提取杜仲葉內(nèi)成分，以黃酮含量為指標(biāo)來(lái)反映酶制劑在杜仲葉提取時(shí)的效果，以期獲得提取率高、品質(zhì)好的杜仲葉浸出產(chǎn)品，為杜仲茶生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

杜仲葉，靈寶帥華牧業(yè)有限責(zé)任公司提供；蘆?。兌取?5.0%），北京來(lái)萊寶技有限公司提供；中性蛋白酶（酶活≥40萬(wàn)U/g）、果膠酶（酶活≥120萬(wàn)U/g）、纖維素酶（酶活≥1萬(wàn)U/g）、單寧酶（酶活≥10萬(wàn)U/g），佳味源實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

LH-08B連續(xù)流粉碎機(jī)，長(zhǎng)沙市中勝制藥機(jī)械廠；HA-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制器有限公司；UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法與步驟

1.3.1 提取工藝流程

杜仲葉→干燥→粉碎→酶解浸提→過(guò)濾去渣→測(cè)定活性成分含量

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）7月份采摘杜仲葉片相關(guān)參照文獻(xiàn)晾曬3-4天后240℃殺青[7-8]；

（2）取經(jīng)殺青處理的杜仲葉片，根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果粉碎成40-80目，然后迅速置于自封袋，在陰涼處遮光保存；

（3）以杜仲葉粉末質(zhì)量計(jì)，蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、單寧酶用量均設(shè)0.05%、0.10%、0.15%、0.20%4個(gè)梯度。制成杜仲葉水比為1∶50的混合液，35℃、45℃、55℃水浴加熱30min以未加酶制劑的為對(duì)照，同時(shí)做3組平行試驗(yàn)；

（4）水浴后的樣液加1.5倍沸水，趁熱減壓過(guò)濾；

1.3.3 黃酮含量測(cè)定參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用60%的乙醇溶解，超聲波助溶，定容至100mL，及配置成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶 液0.50、0.75、1.00、1.30、1.50、1.80、2.00mL定容至10mL，400nm處分別測(cè)量其吸光度。以溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，黃酮的濃度為橫坐標(biāo)作黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

線性回歸得到計(jì)算公式為：y=0.225x（y為吸光度，x為濃度）R2=0.999。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上各取3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶對(duì)黃酮量的影響

蛋白酶對(duì)黃酮含量影響見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白酶添加量與黃酮含量之間關(guān)系

圖2顯示，各處理溫度條件下，隨著蛋白酶添加量的增加黃酮呈先升高后降低趨勢(shì)，添加同劑量的酶制劑，35℃條件下的黃酮含量均高于45℃、55℃，這說(shuō)明35℃是蛋白酶的最佳使用溫度。由圖5可知，35℃條件下蛋白酶添加量0.15%時(shí)黃酮含量最大，為9.51mg/g。因此，蛋白酶的最佳使用條件是添加量0.15%、溫度35℃。

2.2 果膠酶對(duì)黃酮含量的影響

果膠酶對(duì)黃酮含量影響見(jiàn)圖3。

圖3 果膠酶添加量與黃酮含量之間關(guān)系

由圖3可知，各處理溫度條件下，隨著果膠酶添加量增加處理組黃酮含量呈先上升后降低趨勢(shì)，且均高于對(duì)照，說(shuō)明適當(dāng)?shù)墓z酶添加是有利于黃酮浸出和擴(kuò)散的。由圖3可知，果膠酶的最佳使用條件是添加量0.10%、溫度35℃。

2.3 纖維素酶對(duì)黃酮含量的影響

纖維素酶對(duì)黃酮含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 纖維素酶添加量與黃酮含量之間關(guān)系

由圖4可知，各處理溫度下，隨著纖維素酶添加量增加處理組黃酮含量呈先上升后降低趨勢(shì)，且溫度越高，同劑量酶制劑條件下黃酮含量越高，說(shuō)明適當(dāng)?shù)奶岣邷囟扔欣邳S酮的浸出。由圖8可知，纖維素酶的最佳使用條件是添加量0.15%、溫度55℃。

2.4 單寧酶對(duì)黃酮含量的影響

單寧酶對(duì)黃銅含量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 單寧酶添加量與黃酮含量之間關(guān)系

圖5顯示，35℃、45℃條件下，處理組黃酮含量隨著單寧酶添加量增加呈先升高后降低趨勢(shì)；45℃條件下各處理組黃酮含量均低于對(duì)照組，說(shuō)明此溫度下添加單寧酶對(duì)于黃酮浸出和擴(kuò)散時(shí)不利的；由圖5可知，單寧酶的最佳使用條件是添加量為0.05%、溫度35℃。

2.5 復(fù)合酶制劑對(duì)杜仲葉黃酮提取效果的影響

由單因素處理結(jié)果可知：4個(gè)處理結(jié)果中最適溫度條件為35℃有3個(gè)，最適溫度為55℃的有1個(gè)，考慮到進(jìn)經(jīng)濟(jì)成本確定復(fù)合酶制劑的最佳使用溫度定為35℃。單因素試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，果膠酶處理后過(guò)濾難度非常大，因?yàn)槊钢苿┲g存在協(xié)同增效作用，氫正交試驗(yàn)時(shí)單寧酶的最大添加量設(shè)定為0.05%。復(fù)合酶制劑處理結(jié)果如表2。

根據(jù)表2可知，影響黃酮含量的因素主次排序?yàn)椋旱鞍酌福締螌幟福纠w維素酶＞果膠酶，蛋白酶對(duì)黃酮含量影響最大，其次是單寧酶。蛋白酶最佳添加量為0.15%，纖維素酶為0.15%，單寧酶為0.01%，果膠酶為0.05%。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用復(fù)合酶制劑處理時(shí)，酶解后過(guò)濾難度比除果膠酶外的其他單一酶制劑大，但是比單一果膠酶難度要小很多。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

按照100g杜仲葉添加蛋白酶0.15g、果膠酶0.05g，纖維素酶0.15g、單寧酶0.01g進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，該復(fù)合酶制劑能提高杜仲葉成分的提取率。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，查明復(fù)合酶制劑有利于杜仲葉黃酮的提??；通過(guò)正交試驗(yàn)，確定在35℃條件下，酶制劑對(duì)提取效果影響的主次因素排序?yàn)椋旱鞍酌福締螌幟福纠w維素酶＞果膠酶；添加蛋白酶0.15%、果膠酶0.05%，纖維素酶0.15%、單寧酶0.01%時(shí)，杜仲葉黃酮含量為9.69mg/g，高出對(duì)照組23.28%，實(shí)現(xiàn)了提高杜仲資源利用率的目的。