李園園 蘇峰 王艷 欒興龍★
作者單位:1.濟寧醫(yī)學(xué)院附屬湖西醫(yī)院消化內(nèi)科,山東,菏澤274000
2.單縣中心醫(yī)院消化內(nèi)科,山東,菏澤274000
慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)主要由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)長期感染引起,是世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題之一。CHB 病程較長時可引起患者肝細胞損傷,并使肝臟出現(xiàn)纖維化甚至肝硬化[1]。肝硬化是誘發(fā)肝癌最常見的原因,相關(guān)研究顯示,通過對慢性乙肝患者不同肝纖維化程度進行區(qū)分診斷,及時監(jiān)測肝纖維化進展,進行恰當?shù)母深A(yù)可使疾病進展減緩或穩(wěn)定在一定階段,對延長慢性乙肝患者的生存時間和改善生活質(zhì)量有重要意義[2]。在CHB患者肝細胞破壞、肝纖維化形成的過程中堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b?FGF)和轉(zhuǎn)化生長因子?β1(transforming growth factor?β,TGF?β1)的作用逐漸受到關(guān)注[3]。此外,微小RNA(microRNA,miRNA)作為重要的調(diào)控分子,是分子水平上監(jiān)測疾病進展的敏感指標[4]。miR?34 家族包含由兩種不同基因編碼的三個microRNA:miR?34a、miR?34b 和miR?34c。近年來,miRNA?34 家族在CHB 中的表達異常為肝纖維化的診斷等提供了新靶點[5]。本研究通過分析b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 在CHB 患者中的表達情況,旨在探討三者聯(lián)合對肝纖維化診斷、病情評估的價值,現(xiàn)報道如下。
選取2018年9月至2020年9月本院收治的180 例CHB 患者作為CHB 組,其中男性92 例,女性88 例,年齡平均(48.52±6.18)歲。納入標準:①HbeAg 均為陽性并接受肝活檢檢查;②符合《病毒性肝炎防治方案》[6]中慢性乙型肝炎診及《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[7]肝纖維化診斷標準。排除標準:①感染甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒引起的肝功能異常;②合并內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)疾病及心、腎功能衰竭者;③合并肝癌、脂肪肝等其他類型肝臟疾??;④既往存在肝臟或膽切除術(shù)者;⑤哺乳期或妊娠婦女。依據(jù)肝臟硬度測量值(liver stillness measurement,LSM)[8]將患者分為輕度肝纖維化組43 例(LSM<9.7 kPa)、中度肝纖維化組78 例(9.7 kPa≤LSM<17.5 kPa)、重度肝纖維化組59 例(LSM≥17.5 kPa)。
同時選取170 例同期于本院接受健康體檢且結(jié)果正常者作為對照組,其中男性89 例,女81 例,年齡平均年齡(48.58±6.19)歲。CHB 組、對照組年齡及性別等基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書,本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準。
1.2.1 血清b?FGF、TGF?β1 檢測
抽取所有研究對象空腹靜脈血3 mL,離心(2 000 r/min,15 min)去除殘余細胞成分,取上層血清置于-70℃待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測b?FGF、TGF?β1 水平,試劑盒北京北方生物技術(shù)研究所提供,操作步驟嚴格按說明書執(zhí)行。
1.2.2 血microRNA?34a 檢測
血清標本收集:清晨空腹抽取所有研究對象外周靜脈血3 mL 于試管中,靜置20 min 后離心(8 000 r/min,4℃,10 min)去除殘余細胞成分,取上層血清轉(zhuǎn)移至另一試管中,再次離心(1 300 r/min。4℃,10 min),最后取500 μL 血清轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP 管中分裝,放入-80℃冰箱保存。采用逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量?PCR 法檢測血microRNA?34a 水平。miScript II RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國QIAGEN 公司,反應(yīng)體系為:miScriptHispct(5x)4 μL,miScriptNucleics(10x)2 μL,miScript Reverse Transcriptase 2 μL,RNA 模板12 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件:37℃60 min,95℃10 min。按照試劑盒進行qPCR 反應(yīng)(miScript SYBR Green 試劑盒,德國QIAGEN 公司),反應(yīng)體系10 μL;預(yù)加熱95℃30 min;變性94℃15 s,退火55℃30 s,延伸70℃30 s,共40 個循環(huán)。Ct 值為反應(yīng)孔的熒光信號達到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。采用U6 作為內(nèi)參,血清中miRNA?34a 的相對表達量為為2?△Ct=CtmiRNA?34a?CtU6。
應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,計量資料以()表示,組間比較采用t檢驗,多組間行F檢驗;相關(guān)性采用Pearson 分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
CHB 組血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 CHB 組與對照組血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較(±s)Table 1 Comparison of serum levels of b?FGF,TGF?β1 and microRNA?34a between CHB group and control group(±s)
表1 CHB 組與對照組血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較(±s)Table 1 Comparison of serum levels of b?FGF,TGF?β1 and microRNA?34a between CHB group and control group(±s)
組別CHB 組對照t 值P 值n 180 170--b?FGF(pg/mL)36.90±10.25 13.08±3.52 28.740<0.001 TGF?β1(pg/mL)596.85±123.74 302.52±56.21 28.370<0.001 microRNA?34a 0.95±0.32 0.21±0.05 29.807<0.001
不同肝纖維化程度患者b?FGF、TGF?β1、mi?croRNA?34a 水平比較:輕度纖維化組<中度纖維化組<重度纖維化組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
表2 不同肝纖維化程度患者血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum levels of b?FGF,TGF?β1 and microRNA?34a in patients with different degrees of liver fibrosis(±s)
表2 不同肝纖維化程度患者血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum levels of b?FGF,TGF?β1 and microRNA?34a in patients with different degrees of liver fibrosis(±s)
注:與輕度肝纖維化組比較,aP<0.05;與中度肝纖維化組比較,bP<0.05。
組別輕度肝纖維化組中度肝纖維化組重度肝纖維化組F 值P 值n 43 78 59--b?FGF(pg/mL)25.81±9.68 34.78±9.75a 43.56±8.51ab 45.30<0.001 TGF?β1(pg/mL)497.36±117.52 558.39±119.80a 632.50±85.72ab 19.58<0.001 microRNA?34a 0.63±0.29 0.84±0.25a 1.12±0.16ab 55.91<0.001
CHB 患者b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 水平與LSM 呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3、圖1。
表3 CHB 患者b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 水平與LSM 的相關(guān)性Table 3 Correlation between the levels of b?FGF,TGF?β1 and microRNA?34a and LSM in CHB patients
圖1 CHB 患者b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 水平與肝纖維化程度的相關(guān)性分析散點圖Figure 1 Scatter diagram of correlation analysis between b?FGF,TGF?β1 and microRNA?34a levels and liver fibrosis in CHB patients
CHB 的危害性在于其可發(fā)展成為嚴重的肝臟疾病及產(chǎn)生相關(guān)并發(fā)癥,導(dǎo)致慢性乙肝患者的高死亡率[9]。因此,診斷慢性乙肝患者肝纖維化的存在、鑒別肝纖維化的程度,從而實施合適的治療方法控制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是至關(guān)重要的。
肝穿刺活組織檢查是從組織病理學(xué)的角度診斷肝臟病變,評估疾病預(yù)后,以及輔助判斷臨床治療決策的可行性及為調(diào)整治療方案提供指導(dǎo)的一種參考方法[10]。然而,肝穿刺活組織作為有創(chuàng)侵入性檢查,實施的風(fēng)險性較高;同時由于取樣量的限制,在評估肝纖維化程度時缺乏一定的準確性。由于肝纖維化作為一個極其復(fù)雜的動態(tài)應(yīng)急反應(yīng),是多種細胞、多種因素相互促進和制約的結(jié)果,因此一些血清生物化學(xué)指標逐漸成為臨床監(jiān)測手段,并引起廣泛關(guān)注。
b?FGF 是是成纖維細胞生長因子家族成員之一,主要在調(diào)控細胞分化、增殖中發(fā)揮作用,肝竇內(nèi)皮細胞、成肌纖維樣細胞、血管內(nèi)皮及平滑肌細胞和肝細胞是bFGF 分泌的主要場所[11]。b?FGF 在正常肝臟的表達對維持肝臟生理功能具有重要作用,主要包括維持血管活性、促進組織損傷修復(fù)及激活內(nèi)皮細胞等。研究發(fā)現(xiàn),在肝臟疾病的早期階段,由于肝組織發(fā)生微循環(huán)障礙導(dǎo)致b?FGF 合成增加,刺激內(nèi)皮細胞增生、遷移及分化,促使新血管形成[12]。而在肝病的中后期,b?FGF 在肝血管間隔及肝竇壁表達逐漸增強,一方面可減少細胞外基質(zhì)降解所必需的酶,另一方面則抑制蛋白酶活性物質(zhì),從而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)堆積,影響機體的反應(yīng)性[13]。從本研究中可以看出,隨著肝纖維化程度的不斷加重,b?FGF 水平呈上升趨勢,且CHB患者b?FGF 水平與LSM 呈正相關(guān)關(guān)系,有力地佐證了血清b?FGF 的高表達可加快CHB 病程,通過監(jiān)測b?FGF 水平變化可評估肝纖維化程度,為臨床治療提供思路。
在肝臟中,TGF?β 主要由非實質(zhì)細胞合成,如肌成纖維細胞等。TGF?β1 可刺激肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,從而增加細胞外基質(zhì)的合成,并且TGF?β1 使肝星狀細胞活化后肝星狀細胞又可分泌大量的TGF?β1,造成肝纖維化持續(xù)發(fā)展;同時TGF?β1 還可上調(diào)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原表達,并降低基質(zhì)金屬蛋白酶合成及抑制促進纖溶酶原激活物的表達,降低細胞外基質(zhì)的降解,從而加速纖維化發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果進一步證實TGF?β1 是一種在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用細胞因子。此外,既往文獻顯示,肝炎病毒可通過免疫病理損傷直接或間接引起Kupffer細胞的大量激活、浸潤,進而增加TGF?β1 的分泌[14]。而大量的TGF?β1 又可刺激貯脂細胞和其他間質(zhì)細胞分泌TGF?β1,從而形成惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)CHB 患者TGF?β1 水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系,故對CHB 患者TGF?β1 水平進行監(jiān)測有助于早期肝纖維化的診斷及肝纖維化程度的判斷。
信號通路參與肝星狀細胞凋亡,高表達的miR?27a 和miR?27b 則可參與肝星狀細胞活化并與肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)[15]。動物實驗顯示,在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中,miR?34a 消融處理的小鼠比野生型小鼠的肺纖維化更嚴重[16]。本研究發(fā)現(xiàn)microRNA?34a 水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系,進一步提示血漿miR?34a 可作為鑒別慢性乙肝患者不同肝纖維化階段的新候選標志物。
綜上所述,b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a表達與CHB 纖維化程度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性,聯(lián)合檢測三者表達情況對CHB 病情和纖維化具有一定的診斷價值。