溫膽湯通過CASPR3改善精神分裂癥大鼠的認知障礙

郭育君 周旭輝 易新宇 楊俊 張雪花 侯超

摘要 目的：探討溫膽湯通過接觸蛋白相關蛋白3（CASPR3）對精神分裂癥大鼠認知障礙的影響。方法：將SD大鼠隨機分為正常組，模型組以及觀察組，其中模型組大鼠腹腔注射MK-801 0.6 mg/kg誘導精神分裂癥模型。觀察組大鼠灌胃溫膽湯20 mL/kg，模型組和正常組大鼠灌胃生理鹽水20 mL/kg。采用刻板行為評分方法評定建模后5 min、10 min大鼠的刻板行為評分;采用谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等試劑盒檢測大鼠血清GSH-Px、CAT以及SOD的含量;采用TUNEL法檢測大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率;采用Morris水迷宮測試大鼠的學習記憶功能。采用Western blotting檢測大鼠海馬組織CASPR3蛋白的表達水平。結果：模型組大鼠在建模后5 min、10 min的刻板行為評分，平均逃避潛伏期，神經(jīng)元凋亡率以及CASPR3蛋白表達較正常組升高（P<0.05），而觀察組大鼠低于模型組（P<0.05）;模型組大鼠血清GSH-Px、CAT和SOD含量較正常組降低（P<0.05），而觀察組高于模型組（P<0.05）。結論：溫膽湯可改善大鼠的認知障礙，其作用機制可能與下調(diào)CASPR3蛋白的表達相關。

關鍵詞 溫膽湯;CASPR3;精神分裂癥;認知障礙;氧自由基;凋亡

Wendan Decoction Improves Cognitive Disorder in Schizophrenic Rats through CASPR3

GUO Yujun1，ZHOU Xuhui1，YI Xinyu2，YANG Jun1，ZHNAG Xuehua1，HOU Chao1

（1 Department of Alcohol and Internet Addiction Psychiatry，Brain Hospital of Hunan Province，Changsha 410007，China; 2 Department of Chinese Traditional Rehabilitation Medicine，School of Medicine，Loudi Vocational and Technical College，Loudi 410007，China）

Abstract Objective：To explore the effect of Wendan Decoction on cognitive disorder in schizophrenic rats through contactin associated protein 3 （CASPR3）.Methods：SD rats were randomly divided into a normal group，a model group and an experimental group.In the model group，the rats were intraperitoneally injected with 0.6 mg/kg MK-801 to induce a schizophrenia model.The rats in the experimental group were intragastrically administrated with 20 mL/kg Wendan Decoction，and the rats in the model group and the normal group were intragastrically administrated with 20 mL/kg normal saline.The stereotyped behavior scoring method was used to evaluate the stereotyped behavior scores of the rats 5 and 10 min after modeling.Glutathione peroxidase （GSH-Px），catalase （CAT），superoxide dismutase （SOD） kits were used to detect rat serum GSH-Px，CAT and SOD content.The TUNEL method was used to detect the apoptosis of cerebral cortex neurons in rats.Morris water maze was used to test the learning and memory function of rats.Western blotting was used to detect CASPR3 protein expression in rat hippocampus.Results：The stereotyped behavior scores，average escape latency，neuronal apoptosis rate，and CASPR3 protein expression of rats in the model group were higher than those in the normal group at 5 min and 10 min after modeling （P<0.05），while those of the rats in the experimental group were lower than those in the model group （P<0.05）.The levels of serum GSH-Px，CAT and SOD in the model group were lower than those in the normal group （P<0.05），while those in the experimental group were higher than those in the model group （P<0.05）.Conclusion：Wendan Decoction can reduce the cognitive disorder of rats.Its mechanism may be related to the down-regulation of CASPR3 protein expression.

Keywords Wendan Decoction; CASPR3; Schizophrenia; Cognitive disorder; Oxygen free radical; Apoptosis

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.012

精神分裂癥（Schizophrenia，SCZ）是一種終身性疾病，全球人群患病率達1%，多發(fā)于青壯年;認知障礙是SCZ的一大核心癥狀，主要特征為工作學習記憶力下降，執(zhí)行功能障礙，言語障礙等[1-2]。溫膽湯是臨床上用于“無形之痰”所致的精神疾病，具有理氣化痰、和胃利膽的功效，已有研究表明其可改善SCZ大鼠學習記憶障礙、抗氧化損傷以及海馬組織病理損傷等，對SCZ具有保護作用[3-4]。然而溫膽湯改善SCZ大鼠認知障礙的機制尚不清楚。接觸蛋白相關蛋白3（CASPR3）是一種神經(jīng)細胞黏附因子，有研究發(fā)現(xiàn)其在新生小鼠基底神經(jīng)節(jié)中表達，可參與調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)的神經(jīng)活動[5];既往研究表明CASPR3與SCZ的發(fā)生發(fā)展密切相關，其在SCZ患者中高表達，使用抗精神病類藥物治療后可恢復至正常水平[6]。本研究通過構建SCZ大鼠模型，探討溫膽湯對SCZ大鼠認知障礙的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30只清潔級雌性SD大鼠，5～6周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖南嘉泰實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2020-0006。于室溫22～25 ℃，濕度50%～65%，自然光照，給予充足的飲水和攝食，適應新環(huán)境5 d后進行實驗研究。對大鼠的護理和使用根據(jù)國家衛(wèi)生研究院《實驗室動物護理和使用指南》中的指導原則，并得到湖南省腦科醫(yī)院動物實驗倫理審查委員會的批準（倫理審批號：202001005）。

1.1.2 藥物 溫膽湯處方組成：半夏6 g、茯苓4.5 g、枳實6 g、竹茹6 g、陳皮9 g、生姜3片、紅棗2枚、炙甘草3 g，購自湖南省中醫(yī)院中藥房。將所有藥物浸泡后，首次加藥材量的8倍水沸騰后煎煮40 min，第2次加藥材量的6倍水煎煮30 min，逐次過濾，合并2份藥液后濃縮，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。地卓西平（MK-801），規(guī)格：10 mg/mL，批號：77086-22-7，批準文號：H20080411，購自美國Sigma公司。

1.1.3 試劑與儀器 一抗CASPR3抗體（1∶1 000，貨號：ab198853）、GAPDH（1∶2 000，貨號：ab8245）和二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（1∶2 000，貨號：ab6721）購自上海Abcam公司;化學發(fā)光（ECL）試劑盒（常州天地人和生物科技有限公司，貨號：H30100）;聚氰基丙烯酰正丁酯（BCA）蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0146）;谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）（上海研謹生物科技有限公司，貨號：YJS2294）;過氧化氫酶（CAT）（上海齊源生物科技有限公司，貨號：QYS-23030）;超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（上海研卉生物科技有限公司，貨號：11305）;原位末端標記法（TUNEL）細胞凋亡試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：GS0248）;Morris水迷宮（江蘇塞昂斯生物科技有限公司，型號：SA201）;低溫高速離心機（Sigma公司，美國，型號：3K30）;電泳儀（北京百思佳特科技有限責任公司，型號：xt51752）;轉膜儀（南京中科通儀科技有限公司，型號：TY-201-01）;DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）（深圳百恩維生物科技有限公司，型號：BW120013）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將30只大鼠隨機分為正常組，模型組和觀察組，每組10只。模型組大鼠腹腔注射MK-801 0.6 mg/kg誘導精神分裂癥模型。建模后以刻板行為評分方法評定各組大鼠刻板行為的改變，0分以上表示造模成功[7]。

1.2.2 給藥方法 觀察組大鼠灌胃服用溫膽湯20 mL/kg，模型組和正常組大鼠灌胃服用生理鹽水20 mL/kg。1次/d，連續(xù)干預14 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 大鼠刻板行為評分 在造模成功后的5 min、10 min以刻板行為評分方法評定各組大鼠刻板行為的評分，評分標準：0分，與生理鹽水作用無區(qū)別;1分，動物不連續(xù)地聞，常伴有興奮活動;2分，動物連續(xù)地聞，頭稍有活動，伴有周期性興奮活動;3分，動物連續(xù)地聞、頭部活動多，伴有不連續(xù)地咬、啃、舔動作，并伴有短暫的興奮期;4分，動物連續(xù)地咬、啃和舔，無興奮活動期，有時全身迅速移位[8]。

1.2.3.2 大鼠定位航行實驗 在進行定位航行實驗前，先將大鼠逐一放入Morris水迷宮中（無平臺）自由游泳3 min，熟悉適應環(huán)境，定位航行試驗歷時5 d，設定逃避潛伏期為60 s，每天隨機選取入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄其逃避潛伏期，即從入水到找到隱藏在水面下平臺的時間。

1.2.3.3 大鼠體內(nèi)氧自由基含量檢測 大鼠腹主動脈取血6 mL，離心后取血清，使用GSH-Px、CAT、SOD檢測試劑盒并根據(jù)操作說明，檢測各組大鼠血清GSH-Px、CAT、SOD含量。

1.2.3.4 TUNEL染色實驗檢測神經(jīng)元凋亡率 取大鼠腦組織，將大腦皮質(zhì)剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化10 min，終止消化后在DMEM完全培養(yǎng)基中吹打成細胞懸液，靜置取上清液，收集細胞。用PBS洗滌細胞，5%多聚甲醛固定5 min，再用PBS沖洗，用蛋白酶K 20 μg/mL消化30 min，PBS沖洗細胞3次，5 min/次，再用3% H2O2和0.1%Triton X-100培養(yǎng)10 min，之后使用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒染色，最后用DAPI標記1 min，37 ℃避光孵育1 h。細胞核染為綠色為凋亡細胞，熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算每組細胞的凋亡率。細胞凋亡率=（凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。

1.2.3.5 Western blotting檢測CASPR3蛋白表達情況 取各組大鼠大腦海馬組織，提取總蛋白后，采用BCA試劑盒定量，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉后加入一抗和二抗室溫孵育2 h，檢測各組CASPR3蛋白表達，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，刻板行為評分以及Morris水迷宮數(shù)據(jù)等計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，當數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，采用Dunnet檢驗;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠刻板行為評分結果 模型組大鼠的刻板行為評分較正常組升高（P<0.05）;觀察組大鼠的刻板行為評分較模型組降低（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠定位航行實驗結果 與正常組比較，模型組大鼠的平均逃避潛伏期顯著延長（P<0.05）;與模型組比較，觀察組大鼠的平均逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠血清氧自由基含量 與正常組比較，模型組大鼠血清GSH-Px、CAT和SOD含量較正常組顯著降低（P<0.05）;觀察組大鼠血清GSH-Px、CAT和SOD含量較模型組顯著升高（P<0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠神經(jīng)元凋亡率 與正常組比較，模型組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，觀察組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著降低（P<0.01）。見表4，圖1。

2.5 各組大鼠海馬組織CASPR3蛋白的表達水平? 模型組大鼠海馬組織中的CASPR3表達水平較正常組顯著升高（P<0.05）;觀察組大鼠海馬組織中的CASPR3表達較模型組顯著降低（P<0.05）。見表5和圖2。

3 討論

SCZ在中醫(yī)學屬于“癲狂”范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期就有其癥狀記載，如《靈樞·經(jīng)脈》：“善恐，心惕惕如人將捕之，喜笑不休，惡人與火，惕然而驚”[9]?，F(xiàn)代病理學研究表明，氧自由基可介導SCZ患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷，而機體清除氧自由基的速率取決于GSH-Px、CAT和SOD等抗氧化酶的活性[10-11]。溫膽湯出自唐代孫思邈《備急千金藥方》，湯中半夏為君藥，和胃降逆，燥濕祛痰;陳皮、生姜為臣藥，理氣和胃、化濕祛痰;竹茹、枳實為佐藥，滌痰開郁，清熱止嘔;甘草調(diào)和諸藥[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，溫膽湯可通過上調(diào)PI3K、Akt、GSK3β蛋白的表達，調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β信號通路，降低SCZ大鼠的刻板行為評分，從而發(fā)揮對SCZ的保護作用[3，14]。本研究通過給予MK-801誘導SCZ大鼠模型，而后給予溫膽湯20 mL/kg治療，結果顯示溫膽湯溫膽湯可改善SCZ大鼠的刻板行為、學習記憶能力以及大鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率，并加大清除大鼠體內(nèi)氧自由基，減輕過氧化損傷。

CASPR3是一種在人腦組織中均有表達的跨膜蛋白，可作用于神經(jīng)系統(tǒng)細胞間通信和膜運輸?shù)纳磉^程[15-16]。既往研究發(fā)現(xiàn)CASPR3在腦功能中發(fā)揮作用，與運動控制和學習有關[17];此外，CASPR3在SCZ患者白細胞中高表達，并參與大腦神經(jīng)網(wǎng)絡的構建和循環(huán)白細胞的自噬，其高表達可能與SCZ發(fā)病有關[18];本研究同樣顯示SCZ大鼠海馬組織中CASPR3蛋白的表達水平顯著升高，這提示了CASPR3在SCZ大鼠海馬組織中表達異常，并可參與SCZ的病理損傷過程;而給予溫膽湯治療后，CASPR3蛋白表達水平顯著降低，這說明溫膽湯可顯著抑制CASPR3蛋白的表達。

綜上所述，本研究證實溫膽湯可通過CASPR3改善SCZ大鼠的認知障礙，該研究為溫膽湯用于SCZ大鼠提供理論依據(jù)。

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（2021-03-08收稿 責任編輯：王明）