北京、河北、山東黃瓜穴盤商品苗壯苗指數(shù)及霜霉病快速抽樣檢測研究

趙立群，田雅楠，曹玲玲，曹彩紅

（北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

0 引言

自2008年集約化育苗成為國內(nèi)農(nóng)業(yè)主管部門主推技術(shù)以來，蔬菜集約化育苗產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，常年生產(chǎn)的蔬菜約2/3采用育苗移栽[1]，對種苗的需求量約為6800億～7300億株，而目前全國集約化育苗供苗量僅約1000億株，市場前景仍然十分廣闊[2]。其中，黃瓜是采用育苗移栽生產(chǎn)最主要的蔬菜種類之一，以壽光為例，黃瓜種苗可占到育苗總量的20%[3]。

對于黃瓜穴盤成品苗質(zhì)量的評價，業(yè)內(nèi)生產(chǎn)者和用苗戶之間普遍采用描述性標(biāo)準（如株高、莖粗、生理苗齡等）作為交貨約定，農(nóng)業(yè)主管部門在2010年之后陸續(xù)出臺的一系列穴盤育苗標(biāo)準中，也主要采用了上述方法，采用目測方法，對黃瓜成苗形態(tài)（株高、莖粗、葉色、生理苗齡、盤根情況等）、病蟲害和機械損傷等指標(biāo)進行規(guī)定，作為成苗或壯苗質(zhì)量標(biāo)準[4-5]。但在實際生產(chǎn)中，當(dāng)用苗戶與育苗場之間就種苗品種純度、壯苗比例、種苗帶病等問題發(fā)生糾紛時，由于一般采用上述經(jīng)驗性的成苗指標(biāo)，雙方很難提供定性依據(jù)，嚴重影響菜農(nóng)經(jīng)濟效益和育苗企業(yè)的信譽[6-7]，也不利于育苗產(chǎn)業(yè)和蔬菜產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)安全高質(zhì)量發(fā)展。

北京和濟南地區(qū)育苗場的生產(chǎn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，霜霉病是黃瓜集約化育苗需要防治的最主要病害之一，由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)引起，設(shè)施內(nèi)可周年發(fā)生危害[8]，在苗期和成株期均可發(fā)病，即使苗期不發(fā)病也可能由于幼苗帶病對后期栽培造成嚴重影響[9]。

筆者從北京、河北、山東的集約化育苗場抽樣采集肉眼所見為健壯且無病蟲害的黃瓜穴盤成苗樣品70份，測算其株高、莖粗、干/鮮質(zhì)量和壯苗指數(shù)等生理指標(biāo)，并通過PCR技術(shù)對其進行黃瓜霜霉病的帶菌情況檢測，旨在探索黃瓜集約化穴盤商品成苗質(zhì)量快速檢測方法，以期為商品苗成苗質(zhì)量評價及苗期病害及早隔離防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗樣品于2018年分別在北京大興、順義、通州、昌平、房山地區(qū)，河北曲周、定興地區(qū)及山東濟南共8地的14家集約化育苗場中采集，按照《蔬菜穴盤育苗通則》(NY/T 2119—2012)中的成品苗要求，隨機抽樣采集肉眼所見為健壯且無病蟲害的黃瓜穴盤成品苗70株，按照1～14號育苗場進行順序編號，每個育苗場采集5份樣品，單株封于自封袋內(nèi)，按照“n號育苗場-第n株”進行標(biāo)記，樣品于次日在實驗室內(nèi)進行各項生理指標(biāo)和霜霉病檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理指標(biāo)檢測 株高用直尺測量基質(zhì)表面到幼苗生長點的高度；莖粗用游標(biāo)卡尺測量幼苗莖基部上方1 cm處；將根部清洗除盡基質(zhì)后吸干水分，與地上部鮮質(zhì)量分別用1/1000天平稱量；在通風(fēng)干燥箱105℃下殺青30 min，80℃烘至恒重，再用1/1000天平分別稱量干質(zhì)量。每份樣品每個指標(biāo)測量3次重復(fù)后取平均值。

1.2.2 霜霉病檢測

（1）按照Quick DNA Isolation Kit（快速提取DNA試劑盒）說明書提取DNA，提取物為黃瓜全基因組DNA和黃瓜葉面附著菌DNA混合液。提取的DNA溶解于TE緩沖液中，測定DNA濃度并稀釋至10～20 ng/μL待用。

（2）根據(jù)黃瓜霜霉病病原菌古巴假霜霉菌病原菌DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS設(shè)計的通用引物進行霜霉病檢測[10]，目標(biāo)擴增產(chǎn)物長度為650 bp，具體引物名稱及序列見表1。

表1 PCR引物名稱及序列

（3）利用高通量PCR技術(shù)擴增目標(biāo)條帶，PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20軟件及Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜穴盤苗采樣情況

試驗共抽樣采集樣品70份，品種均為當(dāng)?shù)貙嶋H采用訂單式銷售的華北型黃瓜，其中大興20份、順義10份、通州15份、昌平5份、房山5份、曲周5份、定興5份、濟南5份。黃瓜秧苗均為集約化方式生產(chǎn)，采用50孔穴盤，生理苗齡1～4葉1心。

2.2 黃瓜穴盤苗生理指標(biāo)比較

對采集的70份樣品進行生理苗齡、株高、莖粗、地上部鮮重、地上部干重、根鮮重、根干重、壯苗指數(shù)等指標(biāo)的測算，并按照每育苗場取平均值。結(jié)果（表2）表明，各育苗場間黃瓜成苗平均壯苗指數(shù)相差較大，最大值0.196來自通州的9號育苗場，最小值0.017為來自大興的2號育苗場，但兩者生理苗齡差別較大，前者為4葉1心，后者為1葉1心。

本試驗對壯苗指數(shù)與表2中各項生理指標(biāo)的相關(guān)性分析（圖1）表明，根干重與壯苗指數(shù)的相關(guān)系數(shù)最大，達到0.995，呈顯著正相關(guān)，說明根干重是黃瓜穴盤成苗壯苗指數(shù)大小的決定因素，可用于快速評測黃瓜種苗質(zhì)量。

圖1 各項生理指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

表2 北京、河北、山東部分育苗場黃瓜穴盤苗平均生理指標(biāo)

2.3 霜霉病檢出情況

對采集的70份樣品進行黃瓜霜霉病病原菌目標(biāo)條帶的PCR擴增，結(jié)果（圖2）表明，3號育苗場的第5株、5號育苗場的第1株、7號育苗場的第5株、8號育苗場的第2～5株、9號育苗場的全部5株、10號育苗場的第2～5株、11號育苗場的第1～3株、12號育苗場的第1～3、5株、13號育苗場的第1～2、4～5株和14號育苗場的第4株樣品擴增出約為650 bp的目標(biāo)條帶，提示葉片含有霜霉病病原菌。

圖2 部分樣品霜霉病PCR檢測結(jié)果

2.4 生理與病害試驗結(jié)果匯總分析

70份樣品進行的幼苗質(zhì)量相關(guān)生理指標(biāo)和霜霉病帶菌情況檢測結(jié)果（表3）表明，北京地區(qū)采集的55株樣品中，單株壯苗指數(shù)最大值達到0.256，最小值僅為0.005，平均壯苗指數(shù)0.078，霜霉病檢出率34.55%。河北地區(qū)采集的10份樣品中，單株壯苗指數(shù)最大值為0.132，最小值為0.053，平均壯苗指數(shù)0.079，霜霉病檢出率80.00%。山東地區(qū)采集的5份樣品中，單株壯苗指數(shù)最大值為0.117，最小值為0.086，平均壯苗指數(shù)0.101，霜霉病檢出率20.00%。

表3 北京、河北、山東部分育苗場黃瓜穴盤苗壯苗指數(shù)與霜霉病檢測情況

3 結(jié)論與討論

3.1 黃瓜穴盤苗壯苗指數(shù)結(jié)果評價

國內(nèi)目前育苗場在實際生產(chǎn)和現(xiàn)行黃瓜穴盤苗生產(chǎn)標(biāo)準中，一般通過目測外觀形態(tài)和有無病蟲害來評判黃瓜穴盤苗質(zhì)量，主要依靠經(jīng)驗，人為誤差較大。相比之下，文獻報道中對黃瓜種苗的質(zhì)量評價更為量化和準確，主要通過測定生理指標(biāo)對種苗質(zhì)量進行評價，包括形態(tài)生理指標(biāo)（株高、莖粗、葉面積、地上部/根部干重、地上部/根部鮮重、根冠比、G值、壯苗指數(shù)等）[11-17]及代謝生理指標(biāo)（代謝酶活性、根系活力、葉綠素含量、光合速率等）[18-21]。雖然不同文獻的檢測指標(biāo)及側(cè)重不同，但一般均將壯苗指數(shù)作為種苗評價的基本指標(biāo)。本試驗通過對北京、河北、山東等黃瓜主產(chǎn)區(qū)育苗場隨機抽取的70份穴盤商品苗進行生理指標(biāo)測定分析，獲得了一系列黃瓜幼苗質(zhì)量量化數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，由于生產(chǎn)習(xí)慣和供應(yīng)茬口等原因，各育苗場黃瓜成苗的生理苗齡從1葉1心至4葉1心不等，而且壯苗指數(shù)相差較大，但經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，70份黃瓜種苗的根干重與壯苗指數(shù)的相關(guān)系數(shù)達到0.995，且呈顯著正相關(guān)，表明根干重可以代替壯苗指數(shù)定性評價黃瓜穴盤苗質(zhì)量，用于快速評測黃瓜種苗生理質(zhì)量，提高評價效率。

3.2 黃瓜穴盤苗霜霉病檢測結(jié)果評價

隨著集約化育苗產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展壯大，大型集約化育苗企業(yè)生產(chǎn)的商品苗多銷往周邊多個省市甚至全國，這也使種苗帶病在地區(qū)間傳播成為可能，北京地區(qū)首次報道發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒病即是由種植戶購買的山東種苗帶病[22]傳播所致。傳統(tǒng)的生物學(xué)病害檢測方法基于田間顯性癥狀觀察和病菌分離測定，若處于潛育期的霜霉病葉片不表現(xiàn)癥狀，葉片內(nèi)病原菌含量太低，則檢測耗時較長，待顯癥后已造成損失，不利于病害的預(yù)測和防控[23-24]。黃瓜霜霉病屬于真菌性病害，已有研究表明，真菌rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS區(qū)段既具保守性，在科、屬、種水平上均有特異性序列，有利于低濃度或被高度降解的DNA樣品中ITS區(qū)域的擴增，常用作分子鑒定、診斷和檢測植物病原菌的靶序列[25-26]。本試驗建立的檢測方法，利用霜霉病核糖體基因ITS區(qū)段設(shè)計特異引物進行PCR擴增，從肉眼所見不發(fā)病的健壯幼苗樣品中檢測到葉片攜帶霜霉病病菌，且在北京、河北、山東均有檢出，其中河北地區(qū)檢出率高達80%，表明霜霉病是顯著影響國內(nèi)黃瓜種苗生產(chǎn)和交易的重要病害，PCR技術(shù)可對黃瓜種苗霜霉病等苗期病害進行快速精準的早期鑒定，對進行種苗健康質(zhì)量評價具有重要的指導(dǎo)意義。同時，通過PCR技術(shù)進行苗期病害預(yù)測還可以及時開展病害科學(xué)防治，有效防止病害傳播和蔓延。

筆者對北京、河北、山東黃瓜穴盤商品苗進行抽樣，結(jié)合壯苗生理指標(biāo)測量和病害PCR檢測技術(shù)，快速精準評價了秧苗質(zhì)量，可為黃瓜商品苗質(zhì)量控制和質(zhì)量評價提供依據(jù)，同時為其他蔬菜種苗質(zhì)量評價提供參考。