增強生物工程化的前交叉韌帶基質(zhì)的表面特性用于即時干細胞治療

Xiaohua Yu , Paulos Y. Mengsteab , Ganesh Narayanan , Lakshmi S. Nair ,d,e, Cato T. Laurencin ,d,e,f,g,*

a Connecticut Convergence Institute for Translation in Regenerative Engineering, University of Connecticut Health, Farmington, CT 06030, USA

b Raymond and Beverly Sackler Center for Biological, Physical and Engineering Sciences, University of Connecticut Health, Farmington, CT 06030, USA

c Department of Orthopedic Surgery, University of Connecticut Health, Farmington, CT 06030, USA

d Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut, Storrs, CT 06269, USA

e Department of Materials Science and Engineering, University of Connecticut, Storrs, CT 06269, USA

f Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Connecticut, Storrs, CT 06269, USA

g Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health, Farmington, CT 06030, USA

1. 引言

前交叉韌帶（ACL）是人體膝關(guān)節(jié)最常見的易損韌帶。由于血管形成能力有限，韌帶損傷后愈合速度緩慢且效果較差，因此需要進行手術(shù)干預(yù)。每年在美國進行的ACL重建手術(shù)超過2.5 × 105次，醫(yī)療系統(tǒng)每年的成本約為180億美元[1]。目前治療方法包括使用患者自己的髕骨或半腱肌肌腱（自體移植物）或同種異體移植物[2-4]。與使用自體移植物相關(guān)的局限性包括有限的可獲得性和潛在的供體部位的發(fā)病率。同種異體移植物可能會傳播疾病，并有可能引起對宿主不利的免疫原性反應(yīng)?；谔祭w維、聚對苯二甲酸乙二酯（Leeds-Keio韌帶）、聚丙烯（Kennedy韌帶增強器）和聚四氟乙烯（Gore-Tex?）合成的不可降解替代品效果有限，并存在應(yīng)力遮擋、疲勞、蠕變和磨損的碎片，最終會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎和滑膜炎[5-11]。這些合成的替代物作為義肢，并不是用來再生天然ACL組織的。因此，迫切需要開發(fā)一種替代治療策略，促使韌帶組織再生。我們初步進行的體外和小動物研究已經(jīng)證明了開發(fā)生物工程化的和可生物降解的三維（3D）支架以支持韌帶再生的可行性 [12,13]。

我們首先研究了不同的合成高分子纖維對開發(fā)3D構(gòu)建體的適用性[14]。在研究各種不同的可生物降解的和生物相容性合成聚合物中，選擇左旋聚乳酸（PLLA）纖維是由于其結(jié)構(gòu)的完整性和長期的優(yōu)異機械性能，以及美國食品和藥品管理局（FDA）對聚合物臨床應(yīng)用的許可[15]。支架的3D結(jié)構(gòu)在細胞向內(nèi)生長和組織再生中起著至關(guān)重要的作用，并且需要具有與天然ACL類似的可控孔徑、集成孔和機械性能[16]。因此，我們開發(fā)了一種具有層次結(jié)構(gòu)的編織支架，該結(jié)構(gòu)類似于天然ACL，由PLLA超細纖維組成，以束狀排列并纏繞在支架的整個厚度方向上。層次結(jié)構(gòu)由三個區(qū)域編織而成：股骨骨道附著位點、關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域和脛骨骨道附著位點[17]。改變纖維的取向以引起孔徑的變化，促進韌帶和骨長入以及這些不同區(qū)域中的血管形成。根據(jù)骨和軟組織長入的最佳孔徑的研究表明，骨附著區(qū)域的孔徑大約為150 μm，而關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域的孔徑為200～250 μm [18]。另外，編織過程形成了一個連續(xù)的相互連接的孔隙結(jié)構(gòu)，增加了細胞附著的可用表面積，通過允許組織在整個基質(zhì)中長入，可以增強再生反應(yīng)[16]。我們的體外研究通過顯示該結(jié)構(gòu)支持細胞黏附、生長和基質(zhì)沉積的能力，支持了這一假設(shè)[19]。從生物力學(xué)的角度來看，骨附著部位相對較小的孔徑或較高的編織角度可能會顯著改善骨道中的定著能力并提供耐磨性。此外，獨特的編織工藝使纖維可以在整個編織厚度上進行編織，增大了編織的韌性和強度，以防止斷裂[14]。該設(shè)計概念在兔模型中得到初步驗證，該研究證實了植入3D支架的可行性以及該結(jié)構(gòu)支持組織長入的能力[12]。通過為期12周的植入研究，我們還證明了將支架與原代ACL細胞相結(jié)合產(chǎn)生的效果比不植入細胞的高分子替代物好[12]。因此，細胞接種對生物工程化的ACL替代物的愈合反應(yīng)和長期性能可以產(chǎn)生有益影響。

再生工程的進展使人們深刻認識到天然細胞外基質(zhì)（ECM）的表面特性（如表面能、形態(tài)和ECM成分）對細胞行為和組織形成的重要性[20]。例如，材料表面能對細胞黏附的影響在文獻中已有詳細記載：高疏水性（水接觸角約為100°或更大）被認為不利于細胞黏附，而高親水性表面則不利于蛋白質(zhì)的吸附[21]。Hanson等[22]證明使用氧等離子體處理可以增強間充質(zhì)干細胞（MSC）在PLLA支架上的黏附。眾所周知，特定的ECM亞單元與整合蛋白和其他細胞表面受體相互作用，導(dǎo)致特定的細胞反應(yīng)，如黏附、增殖和分化[23]。將ECM組件涂覆在支架表面會產(chǎn)生生物指令，從而對細胞反應(yīng)和組織修復(fù)產(chǎn)生有益的影響。該方法的優(yōu)點如下：①這些蛋白質(zhì)/糖蛋白易于從天然原料中提取，價格低廉；②采用各種溫和的涂覆/沉積方法可以很容易地在支架表面涂覆ECM成分；③通過調(diào)節(jié)材料表面的化學(xué)成分可以有效地調(diào)節(jié)ECM成分的保留和釋放。研究已發(fā)現(xiàn)包括I型膠原蛋白和纖連蛋白在內(nèi)的幾種ECM成分在韌帶的發(fā)育和再生中具有生物活性[24-29]。例如，纖連蛋白的存在增強了支架上的細胞增殖和組織生長[14,18,30,31]。另外，纖連蛋白作為體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最豐富的細胞外糖蛋白之一，在韌帶愈合和軟組織保護中也發(fā)揮著作用[32-34]。

先前的體外研究集中于探究支持韌帶再生的最合適的細胞。通過檢測生長于3D編織支架上不同類型的細胞，包括跟腱、髕骨肌腱、內(nèi)側(cè)副韌帶和ACL，對細胞中的I型膠原蛋白、III型膠原蛋白和纖連蛋白——細胞分化和基質(zhì)產(chǎn)生的所有標志物進行表達[19]。與其他細胞相比，三種標志物在ACL細胞中表達水平較高，說明該支架更利于支持ACL細胞功能。將兔的ACL細胞接種到PLLA基質(zhì)上，以進一步表征細胞反應(yīng)（如細胞黏附和增殖）。細胞在早期呈球形結(jié)構(gòu)并緩慢地擴張，表明細胞黏附的表面性能欠佳。后續(xù)研究將細胞黏附纖連蛋白分子吸收到3D編織物中的PLLA纖維的表面以增強細胞附著力[14]。細胞增殖檢測實驗和掃描電子顯微鏡（SEM）圖像證實，向支架中添加纖連蛋白可促進細胞生長。Western blot分析顯示，與不含纖連蛋白的支架相比，接種于含有纖連蛋白的支架上的細胞產(chǎn)生的I型膠原蛋白表達量增加。因此，利用細胞黏附分子改性生物材料表面是一種很有前途的方法，該方法可以提高細胞黏附效率，有助于細胞增殖以及在3D編織基質(zhì)上長期生成基質(zhì)。此外，近來關(guān)于在再生工程中使用自體干細胞的證據(jù)已經(jīng)確立了其在發(fā)展臨床增強韌帶重建策略方面的重要性。

近年來，即時診療干細胞療法已成為再生工程領(lǐng)域的重點。即時診療干細胞療法是指從患者體內(nèi)提取組織，進行處理以產(chǎn)生更高比例的干細胞，然后將干細胞注射回患者體內(nèi)的過程。骨髓來源的單核細胞（BMMNC）是一種很有吸引力的細胞，因為它們易于與自體細胞分離，具有很高的自我復(fù)制能力以及向間充質(zhì)和非間充質(zhì)組織分化的能力[35-38]。BM-MNC與可再生工程化支架的結(jié)合已被證明是多種組織系統(tǒng)再生的一種臨床實用方法[39-45]。例如，研究證明浸泡在骨髓穿刺液中的Healos（I型膠原蛋白/羥基磷灰石基質(zhì)）可產(chǎn)生與后外側(cè)腰椎融合物中自體髂骨相似的再生能力[45]。因此，ACL再生工程增強合成韌帶再生的方法將BMMNC與生物工程化的和可生物降解的3D編織基質(zhì)結(jié)合起來。

這項研究的目的是調(diào)節(jié)預(yù)先建立的3D PLLA生物工程化ACL基質(zhì)的表面性質(zhì)，以增強其支持細胞黏附和生長的能力。為此，對PLLA編織的超細纖維基質(zhì)進行空氣等離子體處理，并通過物理吸附法涂敷纖連蛋白，以增強表面潤濕性并增加細胞黏附表位。根據(jù)孵育時間和纖連蛋白濃度研究纖連蛋白的吸附效率。對于細胞黏附，研究三種不同的空氣等離子體處理時間和纖連蛋白濃度。利用臨床相關(guān)的細胞來源，即兔骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（R-BMMSC）評估這些表面改性對細胞黏附和生長的影響。若經(jīng)空氣等離子體和纖連蛋白吸附處理的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)可以促進R-BMMSC的黏附和增殖，則該表面改性法會成為韌帶重建的一種強化的臨床策略。

2. 材料和方法

2.1. 材料

PLLA絲線（分子量為120 000 Da；固有黏度為1.2～1.6；每30根長絲為120 Denier），購自Biomedical Structures LLC（美國）。人血漿中的纖連蛋白[目錄號（cat#）33016015，GibcoTM，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國]，分子量為440 000 Da，購自Life Technologies Corporation（美國）。每個藥瓶包含1 × 106個細胞的R-BMMSC（cat# RBXMX-01001），購自Cyagen Biosciences Inc.（美國）。CellTiter-Blue?購自Promega Corporation（美國）。Alexa Fluor 488試劑盒的蛋白質(zhì)綴合染料購自Life Technologies Corporation（美國）。Dulbecco的最低必需孵育基（DMEM; cat# 11995）、青霉素-鏈霉素（cat# 15070-063）、胎牛血清（cat# 16000-044）、磷酸鹽緩沖液（PBS; cat# 10010）和0.05%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA; cat# 25300-054）購自Life Technologies Corporation（美國）。

2.2. PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的制備

采用編織技術(shù)制備PLLA編織的超細纖維基質(zhì)。在該技術(shù)中，將20條絲線綁扎成絲束。然后將三個絲束分別綁在鉸鏈銷上。3D編織基質(zhì)是通過手動交替的方式使絲線依此移動而制成的。編織完成后，將單個基質(zhì)（10 mm × 3 mm）切開，并使用電動槍打結(jié)其末端。在包含70%乙醇的錐形管（15 mL）中孵育基質(zhì)，以對其進行滅菌處理，然后在生物安全柜（NuAire，美國）中進行空氣干燥。最后將基質(zhì)的兩面都暴露于紫外線（UV，波長為254 nm）30 min，以完成滅菌過程。

2.3. 空氣等離子體處理

在Harrick等離子清潔器中，將PLLA編織的超細纖維基質(zhì)以大約0.2 Torr（1 Torr = 133.322 Pa）的氣壓和中等功率進行空氣等離子體處理，改變曝光時間（分別為5 min、10 min和15 min）。使用配備高速相機的光學(xué)接觸角（OCA）測角儀（Future Digital Scientific Corp.，美國）進行水接觸角（WCA）測量，觀察表面處理對親水性的影響。在WCA測量時，將每根絲線彼此相鄰放置以制成扁平樣品。然后從絲束上切下1 cm × 5 cm的樣品，放置在樣品臺中，并用雙面碳帶固定。去離子水以1.5 μL·s-1的速度從50 μL注射器中通過金屬針（0.18 mm）。接觸后，儀器會自動捕獲帶有WCA的圖像。

2.4. PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的纖連蛋白吸附

通過纖連蛋白吸附研究纖連蛋白濃度和孵育時間對纖連蛋白覆蓋PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的影響。將Alexa Fluor 488染料與纖連蛋白結(jié)合以評估纖連蛋白在基質(zhì)上的分布。按照制造商的說明進行Alexa Fluor 488-纖連蛋白結(jié)合。綜上所述，將纖連蛋白原液（1 mg·mL-1）加熱至室溫，并在淡黃色小瓶中與染料混合。蛋白染料通過制造商定制的液相色譜柱洗脫。使用UV分光光度計將洗脫的蛋白質(zhì)-染料綴合物均勻化和定量化。然后根據(jù)Beer-Lambert定律，使用以下公式計算標記的纖連蛋白的摩爾濃度（M）：

式中，A280和A494分別是染料在280 nm和494 nm處的吸收；ε是 摩 爾衰減 系數(shù)（ε= 677 800 L·mol-1·cm-1）。稀 釋系數(shù)為1，校正系數(shù)為0.11，利用校正系數(shù)計算染料在280 nm處的吸收。用標記的纖連蛋白原液制備一系列溶液（10 μg·mL-1、25 μg·mL-1和50 μg·mL-1），并將含有纖連蛋白溶液（10 μg·mL-1、25 μg·mL-1和50 μg·mL-1）的基質(zhì)放在藥瓶（2 mL）中孵育。在不同時間段內(nèi)（30 min、60 min和120 min）進行孵育，并在25 ℃下持續(xù)攪拌。然后在PBS中將基質(zhì)洗滌三次以除去松散結(jié)合的纖連蛋白。通過間接測定在酶標儀（synergy? HT，BioTek Instruments, Inc.，美國）孵育前后溶液中的纖連蛋白濃度可知結(jié)合的纖連蛋白含量。

2.5. 細胞孵育

在 裝 有DMEM的T-75燒 瓶 中 孵 育R-BMMSC，DMEM中添加了MSC合格的10%胎牛血清，每毫升100單位（1個單位代表0.6 μg青霉素鈉的比活度，U·mL-1）青霉素和50 μg·mL-1鏈霉素。將在37 ℃的孵育箱中的細胞置于95%的濕空氣和5%的二氧化碳（CO2）環(huán)境下孵育。每兩天更換一次孵育基，每四天傳代一次。為了將細胞接種到基質(zhì)上，以每個基質(zhì)接種1 × 105個細胞的接種密度將基質(zhì)放置在單細胞24孔組織孵育板中，并傳遞4～6代。本文就R-BMMSC對PLLA編織的超細纖維基質(zhì)、PLLA編織的超細纖維基質(zhì)+纖連蛋白、PLLA編織的超細纖維基質(zhì)+空氣等離子體處理，以及空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附的基質(zhì)的響應(yīng)進行了研究。細胞孵育長達21 d，每隔一天更換孵育基。

2.6. 細胞黏附與增殖

通過不同的孵育時間、空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附，研究R-BMMSC在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的黏附和生長。使用激光共聚焦顯微鏡和SEM監(jiān)測細胞黏附。收集樣品并用PBS洗滌以去除非黏附細胞，并確定每個時間點（2 h、8 h和24 h）的細胞黏附力。根據(jù)制造商的說明，分別使用絲狀肌動蛋白（F-actin）和碘化丙啶對黏附的細胞進行細胞骨架蛋白和細胞核染色。染色過程如下：將細胞用PBS徹底漂洗，并在4%的福爾馬林中固定20 min。接下來，用0.1%的TritonX-100（在PBS中）將細胞透性化5 min，用PBS進一步洗滌后，添加50 μL F-actin染色[異硫氰酸熒光素（FITC）-共軛鬼筆毒肽（conjugated phalloidin）]溶液。最后，用碘化丙啶將細胞核染色并孵育20 min，然后去除染色溶液，并利用安裝在Axiovert 200 M上的Zeiss（德國）激光共聚焦顯微鏡510 Meta對細胞成像。

另外，通過SEM觀察在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的細胞形態(tài)。為了進行SEM測量，細胞被放在2.5%戊二醛緩沖液中固定1 h，然后使用具有濃度梯度系列的乙醇溶液將固定細胞脫水（在4 ℃下使用30%、50%和70%的乙醇進行梯度脫水，每次20 min；在室溫下使用90%、95%和100%的乙醇進行梯度脫水，每次20 min；最后將細胞置于100%乙醇中脫水過夜）。在5 kV的加速電壓下使用JSM 6335F（日本電子株式會社）和能量色散X射線光譜儀組件（英國牛津大學(xué)）進行SEM實驗。在進行SEM實驗之前，將樣品（直徑約0.5 cm）切割并通過雙面碳帶放置在金屬柱上，然后使用Polaron E5100鍍膜裝置鍍金約45 s，以產(chǎn)生10 nm的鍍膜。

根據(jù)說明書，使用CellTiter-Blue細胞活力測定法（Promega Corporation，美國）檢測R-BMMSC在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的增殖能力。用PBS徹底清洗細胞，并與10%染料溶液混合放于孵育基中孵育2 h，然后將100 μL的混合物轉(zhuǎn)移到96孔板中，并使用SynergyTMHT微孔板讀數(shù)器（BioTek Instruments, Inc.，美國）在530 nm/590 nm的激發(fā)/發(fā)射波長下進行熒光檢測?；诰哂幸阎毎麛?shù)的標準曲線估計基質(zhì)上的細胞數(shù)。

2.7. 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 7.00分析細胞黏附和增殖數(shù)據(jù)。每個時間點均采用Tukeys post hoc的單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差展示。p＜ 0.05為顯著性差異。細胞黏附動力學(xué)研究中的n= 3。所有其他研究均為n= 4。

3. 結(jié)果與討論

3.1. 纖連蛋白吸附性能的優(yōu)化

圖1為實驗分組示意圖以及PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的代表性SEM圖像。將PLLA編織的超細纖維基質(zhì)分別用纖連蛋白、空氣等離子體處理或空氣等離子體、纖連蛋白吸附處理。首先，通過改變纖連蛋白溶液的濃度和孵育時間來評估纖連蛋白在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的吸附能力。通過使用熒光標記的纖連蛋白可觀察到，纖連蛋白在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的吸附能力與使用的纖連蛋白的濃度相關(guān)[圖2（a）～（d）]。接下來，我們試圖確定孵育時間對纖連蛋白吸附能力的影響。結(jié)果表明，在25 μg·mL-1的纖連蛋白溶液中孵育120 min會顯著增強纖連蛋白在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的吸附能力[圖2（e）]，并顯著提高纖連蛋白的吸附效率 [圖2（f）]。纖連蛋白的吸附在2 h后開始達到平穩(wěn)狀態(tài)，孵育30 min、60 min、120 min后，吸附能力呈非線性趨勢。大多數(shù)研究表明，孵育時間依賴于所用的纖連蛋白濃度和底物類型，而最佳孵育時間可長達4 h [46,47]。研究發(fā)現(xiàn)，纖連蛋白的結(jié)合大約在120 min的時間點趨于平穩(wěn)[圖2（e）]，這與PLLA薄膜在60 min之前表現(xiàn)出快速的纖連蛋白吸附，以及直至60 min后吸附趨于平穩(wěn)是一致的[48]。另外，PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的較高表面積可能導(dǎo)致纖連蛋白的結(jié)合達到飽和狀態(tài)的時間增加。

圖1. 表面改性技術(shù)示意圖。上方圖片為PLLA編織的仿生基質(zhì)的代表性SEM圖像；左下方圖片為在不同濃度的纖連蛋白溶液中孵育PLLA仿生基質(zhì)；下方中間圖片顯示的是暴露于空氣輝光放電等離子體；右下方圖片為將PLLA仿生基質(zhì)暴露于空氣輝光放電等離子體，然后在纖連接蛋白溶液中孵育。

圖2. 表面處理對纖連蛋白吸附和PLLA編織的超細纖維基質(zhì)表面性能的影響。（a）～（d）Fn-Alexa Fluor 488在無纖連蛋白（a）、0.1 μg·mL-1纖連蛋白（b）、1 μg·mL-1纖連蛋白（c）和10 μg·mL-1纖連蛋白（d）的PBS溶液中孵育120 min后在仿生支架上的吸附；（e）纖連蛋白結(jié)合（PBS溶液中含25 μg·mL-1）在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上隨時間的變化；（f）如（e）中所述的纖連蛋白結(jié)合的效率；（g）以不同濃度孵育120 min后纖連蛋白吸附的變化；（h）如（g）中所述的纖連蛋白結(jié)合的效率。*：p ＜ 0.05，**：p ＜ 0.01，***：p ＜ 0.001。

圖2（g）表明纖連蛋白的濃度與纖連蛋白對PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的吸附有直接關(guān)系。與濃度分別為10 μg·mL-1和25 μg·mL-1的纖連蛋白相比，將基質(zhì)放在濃度為50 μg·mL-1的纖連蛋白中孵育120 min后，纖連蛋白的吸附會顯著增加。但是，對于在50 μg·mL-1溶液中孵育的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)，其纖連蛋白吸附效率與在25 μg·mL-1溶液中孵育的基質(zhì)的纖連蛋白吸附效率無顯著差異[圖2（h）]。由于含有纖連蛋白的溶液（25 μg·mL-1和50 μg·mL-1）之間的纖連蛋白結(jié)合效率在統(tǒng)計學(xué)上相似，因此選擇用25 μg·mL-1處理的基質(zhì)開展進一步的實驗?；谠摴に嚌撛诘纳虡I(yè)化價值，纖連蛋白吸附效率的重要性不言而喻，因為在這一過程中，效率的提高可以降低加工成本。

我們的研究表明，纖連蛋白的最大吸附量為50 μg·mL-1，結(jié)合效率為25 μg·mL-1，生物材料表面的纖連蛋白密度飽和值為10 ～25 μg·mL-1[圖2（h）]。纖連蛋白結(jié)合效率的平穩(wěn)狀態(tài)表現(xiàn)為纖連蛋白單層的飽和，隨著纖連蛋白濃度的增加，纖連蛋白的吸附被進一步阻止。這一發(fā)現(xiàn)與之前對其他高分子纖連蛋白的觀察結(jié)果一致[31]。除了蛋白質(zhì)濃度外，孵育時間在預(yù)先確定纖連蛋白吸附率方面也有重要作用。

3.2. 表面改性對R-BMMSC黏附的影響

通過附著在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的細胞數(shù)量來量化表面改性對R-BMMSC黏附的影響。另外，使用免疫熒光檢測法和SEM觀察黏附的細胞形態(tài)。纖連蛋白的吸附可在24 h的時間點促進細胞黏附，并且在10 μg·mL-1和25 μg·mL-1纖連蛋白溶液中孵育的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上顯示的細胞數(shù)量顯著增加[圖3（a）]。隨后進行細胞黏附實驗，以了解細胞黏附動力學(xué)。在纖連蛋白涂層濃度為25 μg·mL-1的條件下，表征24 h（0.5 h、2 h、4 h、8 h和24 h的時間點）的細胞黏附性。從細胞接種后0.5 h開始，基質(zhì)上纖連蛋白涂層的存在就顯著提高了細胞黏附[圖3（b），p≤ 0.0001]，并且隨著孵育時間的增加，這種趨勢繼續(xù)存在。因為ACL重建手術(shù)通常需要1～2 h，在細胞僅接種0.5 h后，細胞黏附性的增加就具有臨床意義。

圖3. 表面改性對R-BMMSC黏附性的影響。（a）在細胞接種24 h后，R-BMMSC的黏附性隨纖連蛋白涂層濃度變化的情況；（b）R-BMMSC在未處理的PLLA ACL基質(zhì)和含纖連蛋白的PLLA ACL基質(zhì)上的黏附動力學(xué)；（c）等離子體處理和纖連蛋白添加引起的R-BMMSC黏附；（d）優(yōu)化的表面改性實驗組的細胞長期存活率評估[纖連蛋白：在20 μg·mL-1纖連蛋白溶液中孵育；空氣等離子體處理（PT）：暴露于空氣輝光放電等離子體5 min；纖連蛋白/PT：暴露于空氣輝光放電等離子體后在纖連蛋白溶液中孵育]；（e、f）R-BMMSC黏附性與時間和表面改性的關(guān)系：免疫染色（e）和SEM（f）。所有誤差條代表標準差。*：p ＜ 0.05，**：p ＜ 0.01，***：p ＜ 0.001，****：p ＜ 0.0001。

研究發(fā)現(xiàn)，對PLLA編織的超細纖維基質(zhì)進行空氣等離子體處理可以降低WCA（見附錄A中的圖S1），并增強R-BMMSC的附著力。等離子體處理的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)在細胞接種24 h后顯示出更高的細胞黏附性，并且在空氣等離子體處理的基質(zhì)中添加纖連蛋白可進一步增強R-BMMSC的黏附性[圖3（c）]。但是，空氣等離子體處理時間超過5 min后，細胞黏附性有下降的趨勢?？諝獾入x子體處理一般通過增加親水性來促進細胞黏附，并且親水性可以通過增加表面粗糙度[49]或添加官能團（如羰基）來提高[50]。然而，親水性過強的表面可能會對細胞黏附產(chǎn)生負面影響。WCA在60°和80°之間對于細胞黏附是最佳的，但會因生物材料而異[50]。本研究發(fā)現(xiàn)PLLA的WCA為79°，經(jīng)空氣等離子體處理5 min后，降低到49°，并在10 min時進一步降低到44°，這證明了細胞黏附降低的潛在原因。鑒于這些結(jié)果，選擇空氣等離子體處理5 min，以進行后續(xù)的長期增殖實驗。

圖3（e）顯示了接種在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)、PLLA編織的超細纖維基質(zhì)+纖連蛋白、PLLA編織的超細纖維基質(zhì)+空氣等離子體處理、空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附基質(zhì)上的細胞形態(tài)。2 h后，R-BMMSC在未處理的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上呈現(xiàn)球形細胞形態(tài)。相比之下，在同一時間點，表面改性組中的細胞具有細長的表面形態(tài)。在8 h和24 h時，PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的R-BMMSC傾向于形成細長的細胞形態(tài)。然而，在這個時間點，無論是用空氣等離子體處理還是用纖連蛋白涂覆的基質(zhì)聯(lián)合空氣等離子體處理，R-BMMSC都表現(xiàn)出更長的梭形形態(tài)和更大的表面積。SEM圖像進一步證實了這些觀察結(jié)果[圖3（f）]，該圖像顯示了在2 h的時間點，PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上附著的細胞較少。這一現(xiàn)象在隨后的時間點繼續(xù)存在，即PLLA編織的超細纖維基質(zhì)上的黏附細胞較少，而空氣等離子體處理基質(zhì)或空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附基質(zhì)上的黏附細胞較多。已有類似的關(guān)于人骨髓干細胞的細胞黏附動力學(xué)結(jié)果被報道：Deligianni等[51]表明，接種在羥基磷灰石基質(zhì)上的人骨髓干細胞在接種后2 h呈圓形，在18 h后開始伸長。也有報道，將纖連蛋白涂覆在載玻片上可使成纖維細胞黏附的時間從316.7 min顯著減少到18.92 min，并且在接種后5 h可顯著增加細胞延伸的次數(shù)[52]。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，纖連蛋白吸附和空氣等離子體處理PLLA編織的超細纖維基質(zhì)是增強細胞黏附性的有效途徑。

3.3. R-BMMSC長期存活和ECM沉積

圖3（d）顯示了R-BMMSC在PLLA編織的超細纖維基質(zhì)、PLLA編織的超細纖維基質(zhì)+纖連蛋白、PLLA編織的超細纖維基質(zhì)+空氣等離子體處理、空氣等離子體處理+纖連蛋白吸附基質(zhì)上的細胞長期生長。在第3天和第7天，經(jīng)空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附的基質(zhì)與對照組和其他表面改性組相比，細胞明顯增多。這種差異的一個可能的原因是PLLA的表面化學(xué)性質(zhì)。Keselowsky等[53]證明表面化學(xué)調(diào)節(jié)纖連蛋白構(gòu)象并導(dǎo)致不同的細胞黏附。在第14天，與未改性的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)相比，經(jīng)等離子體處理和纖連蛋白吸附的基質(zhì)上的R-BMMSC數(shù)量顯著增加，但是在經(jīng)空氣等離子體處理或纖連蛋白吸附的組之間沒有顯著差異。最終，在第21天，空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附的協(xié)同效果均優(yōu)于未處理的基質(zhì)和纖連蛋白吸附的基質(zhì)，但空氣等離子體處理基質(zhì)與空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附基質(zhì)之間沒有差異。總的來說，對生長到21 d的細胞的評估證明表面改性不具有細胞毒性。

R-BMMSC在各種基質(zhì)上的分布可以通過SEM和免疫染色法進行可視化，以進一步揭示基質(zhì)表面改性后的細胞相容性。在孵育21 d后，觀察到表面改性組的細胞覆蓋率比未改性的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的更均勻（圖4，上部的圖）。代表性的細胞核和細胞骨架免疫染色圖證實了表面改性組的細胞覆蓋率提高，顯示了更多的細胞數(shù)量和細胞覆蓋（圖4，下部的圖）。

我們還觀察到PLLA編織的超細纖維基質(zhì)中的超細纖維有助于各向異性的細胞排列。研究表明，亞微米排列的纖維具有各向異性的細胞排列，而直徑15～20 μm的PLLA超細纖維也可以做到這一點[54,55]。如圖5（a）、（b）所示，沿著纖維生長的R-BMMSC，在孵育21 d后，細胞形態(tài)呈拉長趨勢。此外，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附改性的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)與對齊排列的R-BMMSC融合[圖5（d）、（e）]。此外，空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附基質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致在第21天時納米纖維ECM沉積[圖5（f）]。納米纖維ECM沉積表明，表面協(xié)同處理可以很好地刺激新的組織基質(zhì)以對齊排列的方式形成，這將有助于提高植入的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的機械強度。隨著基質(zhì)在體內(nèi)降解，ACL的機械載荷將轉(zhuǎn)移到沉積的ECM。因此，隨著時間的推移，高度對齊排列的ECM對于最大化移植物的抗張強度很重要。

由本研究可知，通過空氣等離子體處理和纖連蛋白改性PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的表面，在細胞接種后30 min內(nèi)可以顯著增強細胞黏附性。此外，R-BMMSC的形態(tài)在改性表面上可較早地伸長。對于PLLA編織的超細纖維基質(zhì)，早期的細胞黏附和伸展對于在骨科應(yīng)用過程中潛在應(yīng)用即時診療干細胞療法非常重要。骨髓穿刺濃縮液在ACL重建中的應(yīng)用近來受到關(guān)注[56]。因此，在手術(shù)過程中增強細胞黏附性將有利于在植入過程中促進細胞在基質(zhì)上的保留。盡管本文沒有進行相關(guān)研究，但是已知細胞伸展與細胞黏附強度有關(guān)[57]，并且足夠的細胞黏附強度對于承受植入過程中施加在基質(zhì)上的力是必需的。未來會進行PLLA編織的超細纖維基質(zhì)在表面改性后對細胞黏附強度影響的相關(guān)研究，并進一步研究體內(nèi)反應(yīng)。

圖4. 在不同處理條件下各種基質(zhì)的R-BMMSC生長和分布。生長在基質(zhì)上的R-BMMSC的SEM顯微照片（上部的圖）顯示，在第21天，與PLLA對照組相比，纖連蛋白、PT和纖連蛋白/PT組的細胞分布更均勻；生長在基質(zhì)上的R-BMMSC的免疫染色（下部的圖）：綠色表示肌動蛋白，紅色表示細胞核（低倍率比例尺：1∶100 μm；高倍率比例尺：1∶50 μm）。

圖5. 在第21天，在纖連蛋白/PT處理的基質(zhì)上，R-BMMSC排列和ECM沉積。（a）纖連蛋白/PT基質(zhì)上的R-BMMSC拉長；（b）、（c）R-BMMSC細胞骨架在纖連蛋白/PT上的免疫染色；（d）、（e）孵育21 d后，覆蓋R-BMMSC的PLLA超細纖維（在纖連蛋白/PT組）的SEM顯微圖像； （f）R-BMMSC在PLLA超細纖維上沉積的納米纖維ECM。

4. 結(jié)論

目前，PLLA編織的超細纖維基質(zhì)可作為ACL重建的自體移植和同種異體移植的可行替代方法。PLLA編織的超細纖維基質(zhì)的優(yōu)勢在于，在患者與患者之間的組織差異性存在的情況下，它提供了一致的材料性能。利用空氣等離子體處理和纖連蛋白吸附，對PLLA編織的超細纖維基質(zhì)進行表面改性后，可顯著增強細胞在基質(zhì)上的黏附和生長。PLLA編織的超細纖維基質(zhì)增強了細胞黏附性能，可在基質(zhì)植入前產(chǎn)生更大的細胞黏附，這對于諸如骨髓穿刺濃縮液的應(yīng)用等即時診療具有吸引力。因表面改性的PLLA編織的超細纖維基質(zhì)而增強的細胞黏附性和增殖能力可能會導(dǎo)致體內(nèi)ACL的再生能力的增強。

Acknowledgements

This research was supported by funding from the Raymond and Beverly Sackler Center for Biomedical, Biological, Physical and Engineering Sciences (NIH R01AR063698, NIH R01AR063698-02S1, and NIH DP1 AR068147). The authors wish to disclose that Cato T. Laurencin and Lakshmi S. Nair have ownership and company interests in Biorez, Incorporated.

Authors’ contribution

Xiaohua Yu performed experiments, performed data analysis, and prepared figures. Paulos Y. Mengsteab performed experiments, performed data analysis, prepared figures, and wrote the manuscript. Ganesh Narayanan assisted in manuscript composition. Lakshmi S. Nair and Cato T. Laurencin oversaw experiments and assisted in manuscript composition.

Compliance with ethics guidelines

Dr. Cato T Laurencin has the following competing financial interests: Biorez, Globus, HOT, HOT Bone, Kuros Bioscience, NPD & Cobb (W Montague) NMA Health Institute. Dr. Lakshmi S Nair has the following competing financial interests: Biorez. Xiaohua Yu, Paulos Y. Mengsteab, Ganesh Narayanan, Lakshmi S. Nair, and Cato T. Laurencin have no other conflict of interest (non-financial) to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.02.010.