人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞穩(wěn)定生產(chǎn)的最新進展

Ikki Horiguchi*, Masahiro Kino-oka

Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University, Osaka 565-0871, Japan

1. 引言

自2006年有關(guān)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）產(chǎn)生的初步報告[1,2]以來，iPSC已成為再生醫(yī)學(xué)[3-6]、藥物篩選[6,7]和食品工業(yè)[8]領(lǐng)域中具有良好前景的細(xì)胞來源。由于其強大的增殖和分化能力，與胚胎干細(xì)胞（ESC）類似，它們能夠作為體內(nèi)各種細(xì)胞類型的可再生來源。此外，由于培育它們不需要使用胚胎，因而不存在倫理問題，且它們的自體移植也不會引起與免疫相關(guān)的并發(fā)癥。伴隨著高度的期望，有關(guān)iPSC的科學(xué)研究在其產(chǎn)生后的10年中迅速發(fā)展。

臨床或工業(yè)相關(guān)的iPSC應(yīng)用需要大量細(xì)胞，而穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)iPSC的方法目前正處于發(fā)展階段。例如，胰島移植需要每個患者至少6 × 108個β細(xì)胞，而其產(chǎn)生需要大約0.6 m2的培養(yǎng)表面[9]，這等同于80個75 cm2大小的培養(yǎng)皿。在極端情況下，制備30%的肝組織需要每個患者6 × 1010個肝細(xì)胞；這些細(xì)胞需從60 m2的培養(yǎng)區(qū)獲得，等于8000個這樣的培養(yǎng)皿。此外，考慮到分化過程的因素，所需的細(xì)胞數(shù)量將達(dá)到上述的兩倍以上。根據(jù)細(xì)胞治療成本估算研究，假設(shè)的批次規(guī)模約為每批次1 × 1010～1 × 1011個細(xì)胞，等于每批次100～10 000管瓶[10-12]。這些要求不能通過實驗室常規(guī)黏附培養(yǎng)（包括手工操作）來實現(xiàn)。因此，有必要開發(fā)一個穩(wěn)定的iPSC制造過程。

各種培養(yǎng)系統(tǒng)都已經(jīng)被研發(fā)至可以產(chǎn)生大量細(xì)胞的階段?；诩?xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)傳統(tǒng)上是為細(xì)胞衍生物開發(fā)的，如染料、疫苗和抗體[13]。使用不同的方法對于細(xì)胞治療應(yīng)用是必不可少的，因為細(xì)胞本身就是產(chǎn)品。雖然iPSC是貼壁依賴性細(xì)胞，但它們也可以通過團聚體的形式在懸浮液中培養(yǎng)。因此，可以使用兩種不同的培養(yǎng)體系培養(yǎng)iPSC：黏附培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。此外，目前正在開發(fā)基于支架的方法控制干細(xì)胞龕以及穩(wěn)定iPSC質(zhì)量。

在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，細(xì)胞灌裝和凍存的下游過程對于開發(fā)穩(wěn)定的iPSC生產(chǎn)系統(tǒng)具有重要意義。由于細(xì)胞質(zhì)量會在生產(chǎn)過程中隨時間而變化，所以立即灌裝和凍存對于穩(wěn)定生產(chǎn)至關(guān)重要。一種用于細(xì)胞治療的高通量灌裝和凍存系統(tǒng)仍在開發(fā)中；因此，缺乏一個合適的下游過程限制了目前的生產(chǎn)規(guī)模。雖然下游過程還沒有發(fā)展到像上游過程那樣得到廣泛的報道，但作為擴大細(xì)胞生產(chǎn)的限制因素，人們已意識到其重要性。

在本文中，我們從上游和下游過程兩方面總結(jié)了穩(wěn)定的iPSC大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)的研究和發(fā)展。首先，我們討論了iPSC培養(yǎng)中的一般限制因素，如養(yǎng)分供應(yīng)、廢物排除和生長因子的存在。關(guān)于上游過程，我們介紹了黏附培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和支架培養(yǎng)系統(tǒng)的特點和發(fā)展。然后，我們討論了限制iPSC生產(chǎn)規(guī)模擴大化的一個因素：下游過程。最后，我們總結(jié)了穩(wěn)定的iPSC生產(chǎn)的最新進展，并提出了為再生醫(yī)學(xué)等新的工業(yè)領(lǐng)域開發(fā)穩(wěn)定生產(chǎn)系統(tǒng)時所涉及的問題。

圖1. 在葡萄糖存在（a）和葡萄糖耗盡（b）的情況下，人類多能干細(xì)胞（hPSC）中的葡萄糖和谷氨酰胺代謝的示意圖。ACO2：烏頭酸酶2；IDH2/3：異檸檬酸脫氫酶2/3基因；αKG：α-酮戊二酸；G6P：葡萄糖-6-磷酸；3PG：3-磷酸甘油醛；ACLY：ATP-檸檬酸裂解酶。轉(zhuǎn)載自參考文獻[21]，經(jīng)Elsevier公司許可，?2016。

2. iPSC培養(yǎng)中的限制因素

2.1. 養(yǎng)分的供應(yīng)和廢物的清除

由于iPSC主要依靠糖酵解來滿足其能量需求[14-17]，所以葡萄糖飼養(yǎng)方式對iPSC培養(yǎng)具有重要意義。一些研究報告顯示，在培養(yǎng)基中保持高葡萄糖濃度可以增強iPSC中多能標(biāo)記物的增殖和表達(dá)[18,19]。這些增強效果的機理尚不清楚；然而，一些報告表明，葡萄糖誘導(dǎo)的高滲透壓對其起著重要作用[19,20]。此外，一些報告提到，谷氨酰胺氧化對人體PSC 的生存也至關(guān)重要[21]。谷氨酰胺代謝不僅有助于核苷酸和谷胱甘肽的合成，而且有助于通過氧化磷酸化促進三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生。在葡萄糖消耗的過程中，谷氨酰胺進行氧化，為三羧酸（TCA）循環(huán)產(chǎn)生ATP?；谶@些研究，iPSC的生產(chǎn)需要葡萄糖和谷氨酰胺的控制，兩者的穩(wěn)定供應(yīng)對于穩(wěn)定生產(chǎn)iPSC十分重要（圖1 [21]）。

在培養(yǎng)過程中，大量的乳酸作為糖酵解的產(chǎn)物，降低了培養(yǎng)基的pH值，導(dǎo)致iPSC的死亡。此外，先前的研究表明，即使在培養(yǎng)過程中控制pH值，乳酸也會降低iPSC的增長率[18]。

這些報告表明，及時供應(yīng)葡萄糖和去除乳酸對iPSC的成功培養(yǎng)至關(guān)重要。以前的研究也表明，連續(xù)供應(yīng)葡萄糖提升了iPSC的增長率和多能性[22,23]。特別是利用透析系統(tǒng)有效且持續(xù)地輸送營養(yǎng)物質(zhì)和排除廢物，能夠保持較好的養(yǎng)分濃度和廢物濃度[23]。然而，這種系統(tǒng)需要額外的設(shè)備，因而也需要更多的空間和一系列復(fù)雜的操作。因此，在利用該系統(tǒng)進行細(xì)胞培養(yǎng)時需要滿足上述要求。

2.2. 氧氣供應(yīng)

氧氣對細(xì)胞培養(yǎng)至關(guān)重要，尤其是在大規(guī)模和高密度的培養(yǎng)過程中。一些關(guān)于二維平面培養(yǎng)的報道明確指出，在透氧膜上進行培養(yǎng)可以形成多層組織并改善細(xì)胞功能[24-26]。然而，在三維培養(yǎng)中，由于內(nèi)部細(xì)胞會因缺乏氧氣而發(fā)生壞死，組織厚度受到氧氣擴散的限制 [27]。

如第2.1節(jié)所述，iPSC通過糖酵解產(chǎn)生其所需的能量，而這一過程不需要氧氣。因此，低氧濃度（＜10%）是維持iPSC的最佳方法，同時也可以阻止iPSC分化[28,29]。然而，氧氣耗竭（＜1%）會延遲iPSC的增殖[29]。因此，將氧濃度保持在3%～10%之間，對于生產(chǎn)質(zhì)量、數(shù)量穩(wěn)定的iPSC至關(guān)重要。大多數(shù)的iPSC培養(yǎng)中，氧氣是由培養(yǎng)基的頂部提供的，也有一些研究采取了通過透氧膜補充氧氣，如封閉系統(tǒng)[30,31]。噴射也是一種有效的供氧方法，然而在iPSC培養(yǎng)過程中，氣泡引起的介質(zhì)流動會影響iPSC的存活率，所以目前很少使用噴射方式。

2.3. 其他添加物

添加生長因子等對于控制細(xì)胞的生長、維持和分化過程十分重要，這同樣適用于iPSC培養(yǎng)。Rho依賴性蛋白激酶（ROCK）抑制劑，如Y-27632和thiazovivin，在人iPSC的培養(yǎng)中具有重要作用。在過去，如果人體iPSC分裂成單細(xì)胞，它們就無法存活，因此，對人體iPSC進行傳代時，細(xì)胞應(yīng)該以小團為基本單位。人體iPSC的傳代是非常困難的，需要專門的技術(shù)。先前的一項研究表明，單獨分離出來的人體iPSC的死亡是ROCK依賴性細(xì)胞凋亡引起的[32]。近來，ROCK抑制劑的加入明顯提高了傳代后的細(xì)胞存活率，簡化了傳代過程。除了提高傳代后的存活率外，ROCK抑制劑對iPSC還有其他作用：提高冷凍保存的效率，支持未分化生長，增強分化[33]。因此，ROCK抑制劑在各種情況下都對人體iPSC的穩(wěn)定生產(chǎn)有幫助。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）是人體iPSC的多能性和自我更新所必需的成分[34-36]，因此它通常被添加到iPSC培養(yǎng)基中。然而，由于bFGF缺乏熱穩(wěn)定性，需要頻繁地更換介質(zhì)，增加了大規(guī)模生產(chǎn)的成本[37]?，F(xiàn)在已有幾種方法可以減少補充bFGF所需介質(zhì)的頻率，如持續(xù)釋放bFGF和提高bFGF的熱穩(wěn)定性[37-39]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族蛋白質(zhì)，如TGF-β蛋白、激活素、nodal和骨形成蛋白（BMP），在維持iPSC的多能性方面也可以發(fā)揮重要作用。TGF-β1已被證明有助于維持人iPSC的多能性[40,41]。Nodal和激活素A激活相同的受體和信號，抑制人iPSC分化，維持其多能性。然而，高濃度的激活素A（約100 ng·mL-1）也促進了人體iPSC向中外胚層細(xì)胞的分化[41,42]。因此，活性素A濃度應(yīng)保持在50 ng·mL-1以下，以保持人iPSC的多能性。BMP4屬于TGF-β超家族，其能夠維持小鼠iPSC的多能性，但會誘導(dǎo)人體iPSC的分化[43,44]。BMP4可從細(xì)胞中分泌，且可以在血清替代培養(yǎng)基中檢測到。拮抗劑頭蛋白（Noggin）與bFGF協(xié)同作用，抑制BMP4的分化誘導(dǎo)，且維持其多能性 [35]。

最后，研究人員報道了包括培養(yǎng)基、基質(zhì)和解離方法等多種因素[45]，能夠影響單代培養(yǎng)和多代培養(yǎng)中的細(xì)胞特征[46]。正如第5節(jié)中所提到的，這些影響穩(wěn)定生產(chǎn)的因素仍然是需要解決的問題。

3. 擴增過程

目前開發(fā)的iPSC大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)基于兩種典型的培養(yǎng)體系：黏附培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。還有一個系統(tǒng)是基于支架的系統(tǒng)，它既包含黏附培養(yǎng)系統(tǒng)，也包含懸浮系統(tǒng)。

3.1. 黏附培養(yǎng)系統(tǒng)

黏附培養(yǎng)是在實驗室中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的一種傳統(tǒng)方法。在傳統(tǒng)的黏附培養(yǎng)中，細(xì)胞被接種到含有飼養(yǎng)細(xì)胞（如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）的基質(zhì)上，這會導(dǎo)致細(xì)胞的交叉污染。近年來，為了實現(xiàn)無飼養(yǎng)iPSC培養(yǎng)，各種細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）涂層被研發(fā)了出來。ECM應(yīng)該包含一種精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序，如基質(zhì)膠、層粘連蛋白或玻璃粘連蛋白，因為iPSC的細(xì)胞-基質(zhì)黏附性主要由整聯(lián)蛋白控制[47]。最早使用動物性的ECM，如基質(zhì)膠。然而，為了確保生物安全，最近已經(jīng)開發(fā)出了包含ECM分子片段的非動物ECM，如層粘連蛋白-511片段[48,49]和玻璃粘連蛋白片段[50]。

為了通過黏附培養(yǎng)來進行大規(guī)模生產(chǎn)，人們需要一個大的培養(yǎng)表面。因此，能夠增加容器中的培養(yǎng)表面積的方法（如疊板）是提高生產(chǎn)力的重要途徑[51,52]。然而，控制培養(yǎng)表面較大的容器很難，所以在不能使用微載體時，擴大培養(yǎng)表面是備用選擇。

自動化培養(yǎng)操作是提高生產(chǎn)力和確保質(zhì)量穩(wěn)定的另一種方法[53-58]。世界各地的許多公司都已經(jīng)開發(fā)出了機械化的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中包括補料和清除廢物雜質(zhì)的導(dǎo)管以及處理實驗設(shè)備（如培養(yǎng)容器、移液管和導(dǎo)管）的機械臂。穩(wěn)定運行以及并行生產(chǎn)的可能性是機械化系統(tǒng)的主要優(yōu)勢。已經(jīng)有報道證實了通過靈活培養(yǎng)平臺進行并行操作的可能性[58]。然而，盡管硬件開發(fā)取得了進步，但用于優(yōu)化操作和監(jiān)控細(xì)胞質(zhì)量的軟件應(yīng)用程序仍在開發(fā)中。細(xì)胞培養(yǎng)的操作過程隨細(xì)胞類型的不同而變化，因此人們需要了解各種操作對細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響和優(yōu)化培養(yǎng)，以確保黏附培養(yǎng)的穩(wěn)定生產(chǎn)。

黏附培養(yǎng)的一個優(yōu)點是容易觀察細(xì)胞形態(tài)。在iPSC培養(yǎng)中，包括維持過程和分化過程，人們每天需要根據(jù)細(xì)胞形態(tài)確定細(xì)胞狀態(tài)。因此，監(jiān)測iPSC菌落的形態(tài)是檢驗其質(zhì)量和穩(wěn)定性的有效方法。這些形態(tài)學(xué)的測定是由經(jīng)驗豐富的專家進行的。這類專家在形態(tài)測定方面的技能和知識取決于操作員的經(jīng)驗，且很難培訓(xùn)其他人員達(dá)到類似的專業(yè)水平。目前正在開發(fā)基于圖像的iPSC質(zhì)量評估分析[59-61]。最近，深度學(xué)習(xí)研究已經(jīng)應(yīng)用于黏附培養(yǎng)中的基于圖像的iPSC質(zhì)量控制中[62,63]。這些方法試圖不使用免疫染色等常規(guī)的生物質(zhì)量檢查來評估iPSC和iPSC衍生細(xì)胞的質(zhì)量，這種方法需要技能，而且會因抗體等試劑的質(zhì)量波動而導(dǎo)致測試結(jié)果的不穩(wěn)定。雖然建立一個可靠的工具需要成千上萬的圖像信息，但這些技術(shù)是監(jiān)測iPSC生產(chǎn)質(zhì)量和穩(wěn)定性的有力工具。

總之，黏附培養(yǎng)是一種常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，可以利用實驗室實驗的知識和經(jīng)驗來保證iPSC的最佳產(chǎn)量。雖然這種培養(yǎng)系統(tǒng)的可擴展性有限，但使用機械化生產(chǎn)系統(tǒng)進行并行生產(chǎn)可以克服這一障礙。為了通過自動化系統(tǒng)實現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)，需要研究每一步操作過程，包括運輸、管道輸送、離心和接種等對細(xì)胞特性的影響。為了了解這些操作的影響，需要了解有關(guān)機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為機械力的生物學(xué)研究[64,65]。此外，還需了解利用化學(xué)工程提取影響細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)以設(shè)計自動培養(yǎng)操作系統(tǒng)。

3.2. 懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)

懸浮培養(yǎng)已被開發(fā)為細(xì)菌[66]、植物[67]和動物細(xì)胞的擴增培養(yǎng)系統(tǒng)，并用于生產(chǎn)各種生物產(chǎn)品，如發(fā)酵食品、藥物以及細(xì)胞本身。與黏附培養(yǎng)不同，懸浮培養(yǎng)不需要黏附表面，因此能夠使用更簡單且易于擴增的容器。一些研究報道了懸浮培養(yǎng)能夠用于iPSC和ESC擴增[66-73]和分化[71-74]。

由于iPSC的形成需要附著，所以它們在懸浮培養(yǎng)物中形成團聚體。由于養(yǎng)分和氧氣在團聚體中的轉(zhuǎn)移存在限制[27,75]以及與細(xì)胞系有關(guān)的ECM積累等各種因素，團聚體的尺寸有限。先前的研究表明，一些細(xì)胞系形成了具有殼狀結(jié)構(gòu)的ECM，其包裹細(xì)胞并阻止細(xì)胞生長[76,77]。報告還顯示，缺乏ECM會導(dǎo)致細(xì)胞死亡和不穩(wěn)定的聚集生長[78]。因此，在設(shè)計懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)之前，應(yīng)考慮iPSC系的特性。

由于這些限制，在iPSC懸浮培養(yǎng)過程中，團聚控制是非常重要的，特別是在早期形成較少的團聚體會導(dǎo)致較低的生長的情況時[76]。因此，一個理想的方案是產(chǎn)生許多大小可控的團聚體，且使其細(xì)胞間有足夠的接觸，能穩(wěn)定生長。有人提出了在懸浮培養(yǎng)的早期階段控制團聚的策略。一種應(yīng)用較多的策略是使用微孔板制備均勻團聚體[79]。其他可能的建議包括修改培養(yǎng)基[81]或培養(yǎng)皿[31]，以限制細(xì)胞團聚。此外，通過在培養(yǎng)后期添加降解細(xì)胞間接觸的分子，其將大團聚體分解為小團聚體，能夠有效改善iPSC生長率[30,81,82]。

由于iPSC不需要很高的氧氣供應(yīng)量，所以用于iPSC擴增的生物反應(yīng)器不需要強烈的攪拌，這一點與傳統(tǒng)的微生物生物反應(yīng)器不同。但這并不意味著iPSC的生物反應(yīng)器完全不需要攪拌。iPSC在懸浮培養(yǎng)中形成團聚物，它很容易沉淀和積聚在生物反應(yīng)器的底部，因此需要通過攪拌來防止上述問題。另一方面，在懸浮培養(yǎng)過程中進行攪拌，細(xì)胞會受到介質(zhì)流動產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，這種剪切應(yīng)力影響iPSC的存活[71]和分化[88]。因此，能夠在生物反應(yīng)器中防止沉淀同時也防止造成細(xì)胞損傷的最佳攪拌水平對生物反應(yīng)器的成功懸浮培養(yǎng)十分重要。在設(shè)計用于iPSC懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器時，需估計細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力。由于細(xì)胞上的剪切應(yīng)力難以直接測量，因此建議使用計算流體動力學(xué)來估計剪切應(yīng)力[89-91]。這些基于計算科學(xué)的方法有助于理解剪切應(yīng)力對iPSC的影響，從而開發(fā)出iPSC懸浮培養(yǎng)的最佳生物反應(yīng)器。

目前已為iPSC懸浮培養(yǎng)開發(fā)了各種生物反應(yīng)器。應(yīng)用最多的iPSC懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)是轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)，這一系統(tǒng)已經(jīng)得到廣泛研究[69,70,71,73,74]。在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)中，攪拌器進行攪拌，以實現(xiàn)高水平的氧傳遞，其攪拌速率很高（即約大于100 r·min-1）[66]。相反，在培養(yǎng)iPSC時應(yīng)盡量減少攪拌（即保持在大約60 r·min-1以下），以確保細(xì)胞以最小的剪切應(yīng)力漂浮，因為iPSC不需要高水平的氧傳遞。在轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)基被直接攪拌，能夠形成良好的混合，然而攪拌器產(chǎn)生的剪切應(yīng)力會導(dǎo)致細(xì)胞損傷。一個研究小組研究了振動培養(yǎng)系統(tǒng)[31,72,83]。在振動培養(yǎng)中，振動容器間接攪拌培養(yǎng)基。由于沒有攪拌器，在振動系統(tǒng)中，細(xì)胞的剪切應(yīng)力比在轉(zhuǎn)瓶中低。此外，振動系統(tǒng)的培養(yǎng)皿更簡單，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，且易創(chuàng)建一個封閉的系統(tǒng)來保持無菌條件。在振動培養(yǎng)中，由于攪拌能力較弱，iPSC聚集體傾向于沉積到容器底部，因此還需要進一步的設(shè)計來防止這種沉降。與振動容器系統(tǒng)類似，旋轉(zhuǎn)壁式容器可以實現(xiàn)微重力培養(yǎng)[84]。以往的研究表明，旋轉(zhuǎn)壁式容器產(chǎn)生的微重力增強了細(xì)胞的存活率、增殖能力和分化效率[85,86]。微重力培養(yǎng)系統(tǒng)的一個極端情況——雙向旋轉(zhuǎn)容器系統(tǒng)實現(xiàn)了偽零重力[87]。如上所述，生物反應(yīng)器有各種各樣的類型，須根據(jù)培養(yǎng)的目的（即擴增或分化）和規(guī)模進行選擇。

3.3. 利用支架進行培養(yǎng)

第三種培養(yǎng)系統(tǒng)涉及在微載體和微膠囊等支架上進行培養(yǎng)。微載體能夠提供比傳統(tǒng)黏附培養(yǎng)更大的黏附表面，并廣泛用于大規(guī)模生產(chǎn)黏附依賴性細(xì)胞（如間充質(zhì)干細(xì)胞）。由于iPSC也是黏附依賴性的，因此已有試驗使用基于微載體的培養(yǎng)系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)和分化iPSC [88,92-94]。與靜態(tài)黏附培養(yǎng)物中的細(xì)胞不同，微載體上的細(xì)胞懸浮在攪拌容器中，并受到剪切應(yīng)力，這會影響細(xì)胞的存活和分化（第3.2節(jié)）。此外，在擴增后收集細(xì)胞時，需要從細(xì)胞懸浮液中分離微載體，這一過程會限制培養(yǎng)的規(guī)模。

微載體的選擇對于在微載體上成功培養(yǎng)iPSC非常重要。根據(jù)以往的研究，尺寸、涂層和表面電荷是影響iPSC擴增的重要因素[92]。根據(jù)參考文獻[92]，使用小型微載體（小于100 μm）會導(dǎo)致低細(xì)胞產(chǎn)率。此外，iPSC幾乎不附著或生長在表面帶有負(fù)電荷的微載體上，因此需要一個帶正電荷的表面，如胺共軛。ECM涂層可以改善微載體上的細(xì)胞生長。參考文獻[92]顯示，基質(zhì)膠和層粘連蛋白涂層可以有效地改善細(xì)胞生長。為了解決與微載體分離的問題，人們最近開發(fā)了經(jīng)過酶處理可溶解的新型微載體[94]，通過在擴增后浸提微載體，可以跳過分離過程。

微膠囊化是另一種基于支架的iPSC的培養(yǎng)方法，它可以通過生物打印保護細(xì)胞免受剪切應(yīng)力、控制團聚并制備更好的結(jié)構(gòu)[95]。一些報告表明，封裝可以防止分化并保持iPSC的多能性[96,97]。此外，還可以對微膠囊進行改性，以控制干細(xì)胞龕[98]。雖然這些優(yōu)勢表明iPSC有大批量穩(wěn)定生產(chǎn)的可能性，但在培養(yǎng)后從膠囊中收集iPSC也阻礙了這種基于支架的生產(chǎn)過程的應(yīng)用。

最近已經(jīng)研究了各種封裝材料，如聚乙二醇（PEG）、瓊脂糖[99]和透明質(zhì)酸[100]。應(yīng)用最多的封裝材料是海藻酸鈉水凝膠。當(dāng)藻酸鹽被滴落到二價陽離子溶液中（如鈣、鋇和鐵離子的溶液）時，它會立即形成水凝膠。因此，通過將含有海藻酸鈉溶液的細(xì)胞懸浮液滴落到二價陽離子溶液中，可以很容易地實現(xiàn)細(xì)胞封裝。此外，通過將膠囊浸泡在螯合劑[如乙二胺四乙酸（EDTA）和檸檬酸]或海藻酸鈉裂解酶溶液中，很容易就能浸提海藻酸鈉水凝膠。由于海藻酸鈉水凝膠膠囊表面具有負(fù)電荷，作為對膠囊的進一步處理，通過將水凝膠膠囊浸泡在聚-l-賴氨酸和殼聚糖等聚陽離子中，海藻酸鈉水凝膠可以被聚離子復(fù)合膜覆蓋。在形成聚離子復(fù)合物后，可以通過將包覆的膠囊浸泡在螯合溶液中來制備具有液體芯的空心膠囊[96,97]。先前的研究報告說，僅用海藻酸鹽對多能干細(xì)胞（PSC）進行簡單封裝，會導(dǎo)致細(xì)胞從膠囊中滲漏，并在膠囊外生長，因此形成多離子復(fù)合膜對膠囊中PSC的擴增至關(guān)重要[96,97,101]。

4. 灌裝和凍存過程

在iPSC培養(yǎng)過程中除了考慮iPSC生產(chǎn)過程的上游部分外，還須考慮遵循擴增過程的下游過程。這些下游過程（包括灌裝和凍存過程）對于包裝擴增的細(xì)胞都是至關(guān)重要的。

4.1. 凍存前（灌裝）

在灌裝過程中，將0.5～2.0 mL含有冷凍保護劑的細(xì)胞懸浮液分配到小瓶中是一項耗時的任務(wù)，因為冷凍培養(yǎng)基的毒性能夠影響iPSC在冷凍后的質(zhì)量和存活率?；谶@個問題，灌裝規(guī)模受到了限制，這樣從培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到灌裝系統(tǒng)的整個灌裝過程可以在1 h內(nèi)完成?？紤]到傳統(tǒng)的手工灌裝過程的時間限制，擴增規(guī)模估計約為1～5 L，每批可產(chǎn)生1 × 109～1 × 1010個細(xì)胞。這意味著需要用到幾千到一萬個小瓶來灌裝同一批的細(xì)胞懸浮液。在灌裝過程中，細(xì)胞隨時間衰變，這導(dǎo)致同一批次內(nèi)產(chǎn)生了不可忽視的質(zhì)量差異。先前的一份報告表明，1 h是確保iPSC在冷凍保存介質(zhì)中具有最大存活能力的最佳時間[102]。因此，為了獲得所需的批量規(guī)模，開發(fā)高通量灌裝過程和并行生產(chǎn)系統(tǒng)必不可少。這一限制主要是由于冷凍保存介質(zhì)中的二甲基亞砜（DMSO）引起的。據(jù)報道，DMSO會引起蛋白質(zhì)團聚[104]，并損害線粒體的完整性和膜電位[104]。在iPSC和ESC冷凍保存的情況下，接觸DMSO會降低其多能基因[105,106]，并促進分化標(biāo)志[106]。因此，一種無DMSO的冷凍保存方法被研發(fā)出來。以往的研究表明，乙二醇是DMSO的一種替代品，因其具有較低的毒性和較高的玻璃化效率[107,108]。此外，由乙二醇、蔗糖和羧化聚-L-賴氨酸組成的冷凍介質(zhì)已被證明可以通過抑制冰結(jié)晶來提高緩慢玻璃化后的細(xì)胞存活率[109]。

4.2. 凍存（降溫）

凍存是細(xì)胞生產(chǎn)所涉及的關(guān)鍵操作之一。傳統(tǒng)上，iPSC是通過玻璃化的方式凍存的，即在高導(dǎo)熱容器如ops中用液氮立即冷凍。該技術(shù)開發(fā)用于保存牛卵和胚胎，并用于保存PSC。玻璃化作用可以防止在凍存過程中損傷細(xì)胞形成的晶體。這是一種成功的方法，并已在實驗室規(guī)模中實現(xiàn)了高回收率（在75%以上，緩慢冷卻的回收率為5%～10%）。然而，用于玻璃化的冷凍保存介質(zhì)通常具有高濃度的低溫保護劑，如DMSO和乙二醇，從而使介質(zhì)具有較高的滲透性和毒性。因此，快速解凍對于玻璃化細(xì)胞樣品的成功回收具有重要意義。快速解凍是通過將玻璃化的細(xì)胞樣品浸入預(yù)熱的培養(yǎng)基中實現(xiàn)的。雖然玻璃化是在實驗室中廣泛使用的一種成功的方法，但它在PSC的穩(wěn)定大規(guī)模生產(chǎn)中仍有一定的局限性，如難以控制溫度、由于直接接觸液氮而造成的污染等。先前的一份報告建議設(shè)計一種帶有可拆卸式螺絲帽的培養(yǎng)板，以通過玻璃化法儲存黏附的人ESC，這可能有助于開發(fā)用以處理大量細(xì)胞的自動化系統(tǒng)[110]。

雖然在過去的實驗中，緩慢冷凍表現(xiàn)出較差的性能[111]，但冷凍保存介質(zhì)的發(fā)展[112,113]以及用緩慢冷卻系統(tǒng)進行凍存的方法的進步[114]提高了這些系統(tǒng)的性能及相關(guān)的細(xì)胞產(chǎn)率。如果用于緩慢冷卻的速度太快，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。這些細(xì)胞內(nèi)冰晶會破壞細(xì)胞器和細(xì)胞膜，并在解凍和重新接種期間導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[115,116]。另一方面，凍結(jié)太慢會由于滲透壓而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)失水[115,116]，從而導(dǎo)致細(xì)胞脫水和收縮，導(dǎo)致細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞骨架的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，在緩慢冷卻系統(tǒng)中，冷卻速度應(yīng)該慢到能夠防止細(xì)胞間結(jié)冰，但又快到能夠防止細(xì)胞內(nèi)失水。報告指出的最佳冷卻速率為0.5～1.0 K·min-1[114,116,117]。在緩慢冷卻法中，溫度被控制并逐漸降低到最終溫度（低于-80 ℃）[118]。在這一過程中，一個編程的深度冷凍機被用于緩慢冷卻，同時記錄了各種溫度控制程序。當(dāng)進行擴大規(guī)模凍存時，就需要一個簡單的冷卻程序在批量冷卻中控制許用溫度。這種方法對于擴大規(guī)模可行，但是可接受的溫度差異（即過程的溫度穩(wěn)健性）尚不清楚。缺乏溫度穩(wěn)健性將影響冷凍過程的增容性，因為擴大規(guī)模會導(dǎo)致熱傳導(dǎo)的溫度變化。

目前正在開發(fā)一種深度超冷方法作為另一種使用快速冷卻的方法[119,120]。與傳統(tǒng)的冷凍保存相比，這種方法中的細(xì)胞會在較高的溫度下保存而不進行凍存。這種方法的困難之處是保持過冷水的解凍狀態(tài)，因為它很容易受到各種刺激而形成冰晶。最近的一項研究表明，用不互溶的液體密封表面可以提高穩(wěn)定性，并使研究人員能夠在-10 ～ -7 ℃中將人體紅細(xì)胞儲存100 d [120]。經(jīng)過進一步的開發(fā)，該方法將有望成為儲存細(xì)胞的候選方法。

總之，下游過程仍然是擴大iPSC生產(chǎn)的潛在瓶頸，必須開發(fā)新的方法來優(yōu)化下游過程。為此，有必要研究各種條件對細(xì)胞存活率和質(zhì)量的影響，如冷凍保存介質(zhì)中的懸浮時間和溫差。

4.3. 凍存后（儲存、運輸、解凍）

凍存后，冷凍細(xì)胞懸浮液通常用液氮（液相約-196 ℃，氣相約-170 ℃）儲存在冷凍儲存罐中。低于-130 ℃的溫度是理想的長期細(xì)胞儲存溫度，這是因為在低于-130 ℃的溫度下不存在液態(tài)自由水，而且晶體或玻璃態(tài)具有足夠高的黏度，能夠防止擴散的影響，并完全停止生物時間。雖然許多細(xì)胞系能夠在-90 ～ -70 ℃的溫度下保存數(shù)月或數(shù)年，但在這種情況下，細(xì)胞的生物學(xué)時間并沒有停止，只是變慢。因此，影響細(xì)胞存活率和特征的生物反應(yīng)仍然會發(fā)生，這些影響將會不斷積累。先前的一項研究表明，肝細(xì)胞在-80 ℃儲存時的存活率較低，但在-170 ℃的條件下可維持一年[121]。在細(xì)胞生產(chǎn)過程中，溫度會隨著各種操作而產(chǎn)生波動，如在從冷凍室運輸?shù)絻Υ媸业倪^程中等。此外，冷凍細(xì)胞樣品的運輸方法仍在發(fā)展中。先前的研究報道，儲存過程中的重復(fù)溫度波動降低了細(xì)胞解凍后的存活率[122]。運輸過程中容器的溫度波動和加速度對冷凍細(xì)胞的影響尚不清楚。因此，有必要了解冷凍細(xì)胞質(zhì)量對這些波動的穩(wěn)健性，以便開發(fā)一個穩(wěn)定的冷凍保存系統(tǒng)。

此外，目前還沒有開發(fā)出運輸冷凍細(xì)胞的有效方法。除了適當(dāng)?shù)臒峁芾碇?，運輸振動對冷凍細(xì)胞的影響仍然不清楚，需被考慮在內(nèi)。通過了解冷凍細(xì)胞對溫度變化和力的穩(wěn)健性，可以實現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)品的穩(wěn)定運輸。

解凍細(xì)胞是另一個影響細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)鍵操作。傳統(tǒng)上講，在37 ℃快速解凍細(xì)胞并避免過熱對于細(xì)胞的成功恢復(fù)來說十分重要[116]。因為緩慢融化會因冰晶體變形而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。雖然人們已經(jīng)進行了一些解凍工作，但為了獲得穩(wěn)定和成功的結(jié)果，還需要進一步了解加熱細(xì)胞時發(fā)生的衰變，并優(yōu)化這一過程。

5. 未來展望——阻礙穩(wěn)定生產(chǎn)的問題

如前文所述，有必要開發(fā)一個從擴增過程到灌裝和存凍過程的可擴展過程。盡管人們已經(jīng)在實驗室規(guī)模下PSC進行了大量試驗，但iPSC的穩(wěn)定大規(guī)模生產(chǎn)仍在發(fā)展中。大規(guī)模生產(chǎn)面臨的主要阻礙之一，是iPSC生產(chǎn)中的復(fù)雜操作與手動執(zhí)行。由于手動處理的波動，可能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)量的波動。此外，如第2.3節(jié)所述，在培養(yǎng)過程中細(xì)胞特征在培養(yǎng)過程中隨著時間發(fā)生突變[46,123]。最近的分析表明，細(xì)胞的特征（包括基因表達(dá)和藥物反應(yīng)）在實驗室之間具有廣泛的異質(zhì)性，即使在同一個細(xì)胞株內(nèi)也是如此[124,125]。與抗體等細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)不同，這種異質(zhì)性不容忽視且應(yīng)被最小化，因為iPSC生產(chǎn)過程中的產(chǎn)物是細(xì)胞本身。為了避免這種異質(zhì)性，必須建立一種適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制方法，其中包括開發(fā)評估方法和建立適當(dāng)評估參數(shù)。

同時，還有必要開發(fā)一個可重復(fù)的生產(chǎn)過程。正如第3.1節(jié)所提到的，自動化是實現(xiàn)培養(yǎng)操作高重現(xiàn)性從而穩(wěn)定生產(chǎn)的理想方法。雖然各個行業(yè)都開發(fā)了自動化的培養(yǎng)系統(tǒng)，但從手工處理到自動化處理的操作轉(zhuǎn)換仍在研發(fā)當(dāng)中。這種發(fā)展需要了解細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵操作和參數(shù)?；瘜W(xué)工程知識有助于開發(fā)自動化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)等過程。在化學(xué)工程方面，各種參數(shù)已被用于優(yōu)化細(xì)胞的生產(chǎn)過程。例如，雷諾數(shù)（慣性力與黏性力的比值）用來預(yù)測不同流動條件下的流動模式。在為iPSC開發(fā)一個穩(wěn)定的生產(chǎn)過程時，這些參數(shù)有助于在實際執(zhí)行操作之前預(yù)測操作的結(jié)果。在最近的一項研究中，一個專門研究運輸現(xiàn)象的小組證明，弗勞德數(shù)（流動慣性離心力和物體重力的比值）可以用來預(yù)測接種過程中振動后細(xì)胞的異質(zhì)性[126]。這些參數(shù)設(shè)計和性能指標(biāo)對于開發(fā)穩(wěn)定生產(chǎn)iPSC的方法是必要的。

如第3.1節(jié)所述，在質(zhì)量控制方面，預(yù)計將開發(fā)包括深度學(xué)習(xí)在內(nèi)的生物分析和統(tǒng)計策略。深度學(xué)習(xí)在生物信息學(xué)、計算生物學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用等各個領(lǐng)域正在迅速發(fā)展[127,128]。這些分析可以在不造成細(xì)胞破壞的情況下實現(xiàn)質(zhì)量檢查，并允許通過顯微鏡的延時捕捉進行實時監(jiān)控。然而，這種分析往往也是“黑匣子”模型，因此生物實驗提供的幫助對于建立有效的深度學(xué)習(xí)系統(tǒng)非常重要。

iPSC的穩(wěn)定大規(guī)模生產(chǎn)研發(fā)中面臨的另一個困難是操作以間接的方式影響細(xì)胞。例如，在通過移液分離細(xì)胞的過程中，移液操作可以用流量來定義，然而這種操作以剪切應(yīng)力的形式影響著細(xì)胞。換句話說，在操作過程中可以調(diào)整的參數(shù)和實際影響細(xì)胞的參數(shù)是不同的。因此，進一步研究如何將操作參數(shù)轉(zhuǎn)化為實際影響細(xì)胞的參數(shù)對于開發(fā)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)過程極為重要。這種研究不僅涉及生物學(xué)，還涉及各種工程領(lǐng)域，如力學(xué)、流體力學(xué)和計算工程。

6. 結(jié)論

在本文中，我們討論了iPSC生產(chǎn)中上游過程（如擴增）和下游過程（如灌裝和凍存）的發(fā)展及其在發(fā)展中面臨的困難。我們介紹了黏附、懸浮和基于支架的培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)缺點，并討論了下游過程可能是iPSC大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸。雖然人們對iPSC已經(jīng)研究了幾十年，但iPSC尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。為了確保穩(wěn)定的iPSC生產(chǎn)，必須研究生產(chǎn)過程，以確定細(xì)胞質(zhì)量的評估因素，了解在操作過程中影響細(xì)胞質(zhì)量的因素，并了解這些潛在影響機制。對于這些研究而言，有必要從生物學(xué)、機械工程、物理和計算工程等角度設(shè)計實驗來研究iPSC的生產(chǎn)。上述問題不僅適用于iPSC的生產(chǎn)，而且也適用于其他常見的細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)，如間充質(zhì)干細(xì)胞。因此，解決這些問題的工程方法也將有助于穩(wěn)定生產(chǎn)包括再生組織和人造肉在內(nèi)的各種細(xì)胞產(chǎn)品。

Acknowledgements

This research was supported by Japan Aency for Medical Research and Development (AMED; JP20be0604001).

Compliance with ethics guidelines

Ikki Horiguchi and Masahiro Kino-oka declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.