NLRP3基因多態(tài)性與漢族男性原發(fā)性痛風(fēng)的關(guān)系

迪麗拜爾·阿吉木 王宇婷 葉 飛 苗 蕾

痛風(fēng)是一種以嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起的代謝性疾病，痛風(fēng)患者常伴發(fā)高血糖、高血壓、高血脂、肥胖等多種疾病。近年來隨著人民生活水平的提高，飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)的發(fā)生率呈逐年增長趨勢(shì)，并且呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害患者的身體健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，飲酒和富含高嘌呤飲食是男性痛風(fēng)發(fā)作的主要誘因之一。30多年來,不論是歐美國家還是亞洲國家,痛風(fēng)和高尿酸血癥發(fā)生率均有明顯增長[2,3]。目前全球痛風(fēng)發(fā)生率為0.1%～10.0%,而我國痛風(fēng)發(fā)生率約為2%[4]。美國人群痛風(fēng)的發(fā)生率約為3.9%，法國為0.9%，英國為1.4%～2.5%，德國為1.4%[5]。

血清尿酸鹽濃度的升高是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎最危險(xiǎn)的因素之一，導(dǎo)致尿酸單鈉(MSU)晶體沉積，主要沉積在周圍關(guān)節(jié)內(nèi)和周圍組織，損害關(guān)節(jié)。血清尿酸鹽濃度的升高與環(huán)境因素及遺傳因素相關(guān)[6]。環(huán)境因素包括攝入啤酒、肉類和海鮮等富含嘌呤的食物，攝入會(huì)增加嘌呤核苷酸降解的果糖，自身的體重指數(shù)(BMI)過高以及有利尿藥物服用史，最終導(dǎo)致尿酸產(chǎn)生過剩[7]。多項(xiàng)研究顯示，遺傳因素在原發(fā)性痛風(fēng)中具有重要作用，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20余個(gè)遺傳易感位點(diǎn)[8～10]。NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域亞成員，被證明參與慢性感染炎癥性疾病的先天免疫反應(yīng)[11]。本研究中筆者將290例漢族男性痛風(fēng)患者和302例健康對(duì)照者作為研究的對(duì)象，評(píng)估了痛風(fēng)組和健康對(duì)照組NLRP3基因3種常見的單核苷酸多態(tài)性(SNP:rs35829419、rs7525979和rs3738448)的基因型和等位基因頻率分布，并分析此位點(diǎn)的多態(tài)性是否與痛風(fēng)的發(fā)病相關(guān)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：痛風(fēng)組(n=290)：本研究中痛風(fēng)組患者均來源于2018年1月～2020年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院各門診就診病例和住院的漢族男性病例。已按照國際風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(2015年)分類標(biāo)準(zhǔn)確診為痛風(fēng)，并且所有的痛風(fēng)病例均為漢族男性，患者平均年齡為48±13歲[12]。健康對(duì)照組來源于2018～2020年新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院門診和體檢中心的健康體檢者302例，平均年齡為45±11歲，受試者均為漢族男性，無全身性炎癥病史并排除關(guān)節(jié)炎史，無糖尿病、腎病、高血壓、血脂異常和心臟病等病史，并事先征得每位患者的書面知情同意書，本研究得到新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2.DNA提?。哼^夜禁食后，在研究對(duì)象知情同意的情況下采集研究對(duì)象的空腹外周靜脈血樣5ml，將2ml血樣收集在進(jìn)行過抗凝處理的乙二胺四乙酸(EDTA)試管中，使用DNA提取試劑盒從血液樣本中提取DNA,并在-80℃下保存直至使用，剩余的3ml離心后進(jìn)行生化檢測(cè)。

3.NLRP3基因位點(diǎn)SNP分型(rs35829419、rs7525979、rs3738448)：采用上海天昊生物科技有限公司的SNPscanTM分型試劑盒對(duì)592個(gè)樣本3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因位點(diǎn)分型，采用連接酶連接反應(yīng)(ligase chain reaction,LCR)的高特異性對(duì)SNP位點(diǎn)基因型和等位基因進(jìn)行識(shí)別，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列以及通過連接酶加接反應(yīng)獲得位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的不同長度連接產(chǎn)物，利用標(biāo)記熒光的通用引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過熒光毛細(xì)管電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，最后經(jīng)過對(duì)電泳圖譜的分析獲取各個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。

4.生化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)室檢查：取空腹靜脈血3ml，使用日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量尿酸(SUA)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖(FBG)、高密度脂蛋白(HLD)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(Cr)、血清葡萄糖(GLU)等，所有的檢測(cè)均在新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用Epidata軟件對(duì)問卷資進(jìn)行錄入，使用SPSS 20.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)，采用單因素Logistic回歸分析計(jì)算比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)評(píng)估NLRP3基因多態(tài)性與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)因素之間的關(guān)聯(lián)。用SHEsis在線軟件對(duì)每個(gè)SNP進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn)(HWE)，計(jì)算兩組基因頻率和等位基因頻率及評(píng)估病例組和對(duì)照組的基因型和等位基因比例是否達(dá)到群體遺傳平衡。

結(jié) 果

1.臨床生化指標(biāo)的分析:痛風(fēng)組血糖、尿酸、膽固醇、高密度脂蛋白、肌酐水平均明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、甘油三酯比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表1。

表1 兩組一般資料與生化指標(biāo)比較

2.痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的危險(xiǎn)因素分析:將吸煙、飲酒、高血壓、高血糖、肥胖、TG、TC和尿酸8個(gè)因素作為自變量引入回歸分析發(fā)現(xiàn)吸煙、血糖和尿酸與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)(P<0.05)，詳見表2。

表2 痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)危險(xiǎn)因素的 Logistic 回歸分析結(jié)果

3.基因SNP的Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn)：對(duì)兩組研究對(duì)象rs35829419、rs7525979和rs3738448這3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn)，分析結(jié)果顯示，本研究對(duì)照組群體達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性(P>0.05)，詳見表3。

表3 NLRP3基因的Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn)

4.基因頻率及等位基因頻率分布情況比較：痛風(fēng)組與對(duì)照組NLRP3基因rs35829419、rs7525979和rs3738448位點(diǎn)SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較，rs35829419、rs3738448位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不能說明這2個(gè)位點(diǎn)對(duì)痛風(fēng)的發(fā)生產(chǎn)生作用。rs7525979基因型及等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4。

表4 痛風(fēng)組與對(duì)照組NLRP3基因型及等位基因頻率分布的比較[n(%)]

5.NLRP3 基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡檢驗(yàn)與單倍型分析:NLRP3的3個(gè)SNP位點(diǎn)之間連鎖不平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，rs7525979-rs3738448 處于LD(D′>0.8和r2>0.3被認(rèn)為是顯著LD)。對(duì)這3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析結(jié)果顯示，常見的單體型為CCG、CCT和CTT占所有研究個(gè)體中觀察到的單體型的99.5%。與HC受試者比較，GA病例中單倍型CTT的頻率顯著降低(P<0.05)，而CCT單倍型的頻率顯著增加(P<0.05)。攜帶CTT單倍型的個(gè)體發(fā)生GA的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加(OR=52.961，P<0.05)，而CTT單倍型是發(fā)生痛風(fēng)的保護(hù)因素(OR=0.227，P<0.05),詳見表5。

表5 NLRP3基因單倍型的分布及遺傳風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[n(%)]

結(jié) 果

國內(nèi)外的流行病學(xué)研究資料均表明，痛風(fēng)的患病率呈逐年升高趨勢(shì)，并且與脂代謝紊亂、肥胖、糖尿病及心血管系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)[13]。高嘌呤飲食如攝入過多海產(chǎn)品、動(dòng)物內(nèi)臟等或飲酒均能增加痛風(fēng)的發(fā)生率[14]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組尿酸、膽固醇、高密度脂蛋白、肌酐水平與痛風(fēng)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，吸煙、血糖和高尿酸與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找發(fā)現(xiàn)，人類的NLRP3基因位于1q44染色體上,由11個(gè)外顯子組成，SNP位點(diǎn)共有1000多個(gè)。NLRP3炎性小體在痛風(fēng)發(fā)作中通過IL-1β介導(dǎo)的炎癥發(fā)生和擴(kuò)增起關(guān)鍵的作用。作為痛風(fēng)炎癥發(fā)作時(shí)激活I(lǐng)L-1β的開關(guān)，MSU晶體通過活化NLRP3炎性小體，激活效應(yīng)蛋白胱冬肽酶-1(caspase-1)，進(jìn)而將無活性的白細(xì)胞介素-1前體(pro-IL-1β)剪切加工為成熟的IL-1β，從而引起炎性反應(yīng)[15]。

研究顯示，NALP3炎性體與阿爾茨海默病、腎臟疾病、痛風(fēng)等非感染性炎癥疾病有關(guān)[16]。一項(xiàng)針對(duì)中國人群開展的研究報(bào)告顯示，NLRP3的rs10754558和rs10925019位點(diǎn)促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展[17]。研究發(fā)現(xiàn)，rs7525979位點(diǎn)位于核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域，其多態(tài)性與美國羅克維爾市人群帕金森病有關(guān)[18]。本課題組前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs10754558位點(diǎn)與痛風(fēng)發(fā)病有一定的關(guān)聯(lián)[19]。因此，筆者假設(shè)NALP3炎性小體中的功能性SNP可能參與原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)生。

本研究以290例漢族男性痛風(fēng)患者和302例健康體檢者為研究對(duì)象，選取3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)中rs7525979CC基因型和C等位基因在痛風(fēng)組的分布頻率高于對(duì)照組，兩組分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。痛風(fēng)組rs7525979-C等位基因的頻率為95%，對(duì)照組為81.45%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，提示C等位基因可能是痛風(fēng)發(fā)病的危險(xiǎn)等位基因。痛風(fēng)組rs7525979-T等位基因的頻率顯著低于對(duì)照組，T等位基因可能是痛風(fēng)發(fā)病的保護(hù)基因。痛風(fēng)組攜帶rs7525979-CC基因型的頻率高于對(duì)照組(P=0.000)，攜帶CC基因型的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于攜帶TT基因型的個(gè)體。rs35829419與rs3738448基因型和等位基因頻率在痛風(fēng)和對(duì)照組分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),不能說明這兩個(gè)位點(diǎn)與痛風(fēng)有關(guān)聯(lián)。

進(jìn)一步對(duì)rs35829419、rs3738448、rs7525979這3個(gè)位單倍型分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)可形成ATT、CCG、CTT、CTG、CTT、ACG和ACT 7種單倍型，CCT單倍型痛風(fēng)組的頻率高于對(duì)照組(P<0.05)，而CTT單倍型痛風(fēng)組的頻率顯著低于健康組(P<0.05)，攜帶CTT單倍型的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)較其他單倍型增加(OR=52.961)，而攜帶CCT單倍型的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.227)，CCT單倍型對(duì)痛風(fēng)發(fā)生有保護(hù)作用。

綜上所述，NLRP3基因rs7525979位點(diǎn)的基因多態(tài)性與痛風(fēng)發(fā)病有關(guān)聯(lián)，但是NLRP3基因rs35829419、rs3738448與痛風(fēng)之間未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。NLRP3炎性受體基因多態(tài)性位點(diǎn)與痛風(fēng)是否有關(guān)聯(lián)需要開展進(jìn)一步的臨床和遺傳學(xué)研究，為將來在人群中進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)防、開展臨床基因治療工作和基因芯片等方面的工作提供重要依據(jù)。