草烏葉生物堿分離純化工藝的研究

賽烏其日 新吉樂 特格喜白音 敖登其木格 烏力吉特古斯

摘要 目的：利用制備型高效液相色譜（PHPLC）研究草烏葉生物堿的分離純化工藝為目的。方法：利用苯提取法得到草烏葉苯提取物。利用PHPLC將草烏葉苯提取物進(jìn)行初步分離，分離產(chǎn)物用薄層色譜和分析型液相色譜分析，以確定目標(biāo)峰。再次用PHPLC對(duì)目標(biāo)峰進(jìn)行分離和純化，對(duì)所得各峰進(jìn)行收集，薄層色譜和分析型液相色譜分析分離產(chǎn)物，驗(yàn)證分離效果。結(jié)果：草烏葉苯提取物經(jīng)PHPLC初步分離后得到峰1～峰12。經(jīng)薄層色譜和分析型液相色譜分析得知峰5～峰10含有大量生物堿。選擇峰5作為研究對(duì)象，進(jìn)一步使用PHPLC進(jìn)行分離純化，得到峰5-1～峰5-12等12個(gè)峰。薄層色譜和分析型液相色譜分析結(jié)果證明，峰5-4基本包含了峰5內(nèi)的生物堿，為目標(biāo)分離產(chǎn)物。結(jié)論：PHPLC初步分離和二次分離建立的色譜條件，可為草烏葉生物堿的大量精制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 草烏葉;生物堿;制備型高效液相色譜

A study of Alkaloids Separation and Purification Method from Leaves of Kusnezoff Monkshood Root

Saiwuqiri1，Xinjile2，Tegexibaiyin2，Aodengqimuge2，Wulijitegusi2

（1 Hang Jin banner Mongolian Medicine General Hospital，Inner Mongolia Autonomous Region，Ordos 017400，China;

2 Inner Mongolia International Mongolian Medicine Hospital，Hohhot 010010，China）

Abstract Objective：To study the alkaloids separation and purification method from leaves of kusnezoff monkshood root using Preparative High Performance Liquid Chromatography（PHPLC）.Methods：benzene extraction method was used to obtain benzene extract from leaves of kusnezoff monkshood root.PHPLC was used to separate ingredients of benzene extract from leaves of kusnezoff monkshood root.Thin layer chromatography（TLC）and High Performance Liquid Chromatography（HPLC）were used to analyze the separated ingredients and determine the target peak.PHPLC was used to purify the target peak，the peaks were collected，the separated products were analyzed by TCL and HPLC to verify the separation effect.Results：A total of 12 Peaks were collected using PHPLC separation，designated as Peak 1～Peak 12.TLC and HPLC analysis showed that Peak 5～Peak 10 were enriched in alkaloids.Peak 5 was selected as an example to receive further PHPLC separation.A total of 12 peaks were seen，defined as Peaks 5-1～Peak 5-12.TLC and HPLC illustrated that Peak 5-4 contained most of alkaloids in Peak 5，which was the target separation product.Conclusion：Chromatographic conditions established by PHPLC primary separation and secondary separation can provide basis for the large-scale extraction of alkaloids from leaves of kusnezoff monkshood root.

Keywords Leaves of kusnezoff monkshood root; Alkaloids; Preparative high performance liquid chromatography

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.006

草烏葉為毛莨科植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥葉。其主要成分為生物堿，草烏中起治療作用和毒性作用的化合物均為烏頭型生物堿。為常用蒙醫(yī)藥，《中華人民共和國藥典》和《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》均收載，有清熱、解毒和止痛等功效，用于熱病發(fā)燒、泄瀉腹痛、頭痛牙痛等。本研究利用制備型高效液相色譜儀分離純化草烏葉生物堿，為了得到純度較高的草烏葉生物提取方法堿奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：GM-0.33A）;華晨高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠，型號(hào)：HCP-1000A）;超純水機(jī)（Millipore，美國，型號(hào)：Milli-Q）;BT 25S電子天平（賽多利斯，德國，型號(hào)：BT 25S）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA，德國，型號(hào)：IKA HB 10 basic）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-52AA）;RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司，型號(hào)：RE-52CS-1）;暗箱三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司，型號(hào)：ZF7）;數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司，型號(hào)：HH-6）;制備型高效液相色譜儀（成都格萊精密儀器有限公司，型號(hào)：GL3250）;高效液相色譜儀（賽默飛世爾，美國，型號(hào)：Dionex Ultimate 3000）。

1.2 試劑 色譜純乙腈（Fisher Scientific，美國，批號(hào)：106246）;色譜純?nèi)野罚ㄌ旖蚴兄逻h(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140726）;色譜純冰醋酸（Fisher Scientific Geel Belgium，美國，批號(hào)：140573）;氨水（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：20140408）;冰乙酸（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào)：20110908）;乙酸乙酯（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：20141008）;正己烷（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào)：20141120）;甲醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130316）;石油醚（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：20140708）;無水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：20150108）;苯（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：20140508）;三氯甲烷（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào)：20140428）;二氯甲烷（沈陽市華東試劑廠，批號(hào)：20121222）;氫氧化鈉（粒）（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào)：20120420）;碘化鉀（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140102）;乙腈（制備級(jí)）（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?hào)：1011241002）。

1.3 分析樣品 草烏葉（亳州市光前中藥材購銷責(zé)任有限公司，批號(hào)：20140317）。

2 方法

2.1 草烏葉化學(xué)成分提取 將干燥的草烏葉用高速粉碎機(jī)粉碎為粉末狀;將粉末狀的草烏葉裝5 000 mL燒杯;加入苯浸泡通風(fēng)櫥放置過夜;將燒杯放入超聲清洗器超聲30 min;靜置后再次超聲30 min;放置1 d后再超聲30 min;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)草烏葉苯提取物，同時(shí)回收苯;將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)的草烏葉苯提取物溶于乙酸乙酯，倒入蒸發(fā)皿，得到草烏葉苯提取物。

2.2 草烏葉苯提取物的薄層色譜分析 將草烏葉苯提取物溶于少量乙腈，超聲助溶，濾紙過濾，得到草烏葉苯提取物的乙腈溶解部分;將以上樣品點(diǎn)樣于硅膠板G。向展開缸加入10 mL展開劑。展開劑為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇=6.4∶3.6∶1。將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開缸，使樣品展開。對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行日光下觀察、利用ZF7型暗箱三用紫外分析儀365 nm下觀察或稀碘化鉍鉀顯色觀察生物堿類化合物，拍照。稀碘化鉍鉀顯色液的配制：堿式硝酸鉍0.085 g溶于1 mL冰醋酸及4 mL水中。碘化鉀2 g溶于水5 mL中。臨用前將上述堿式硝酸鉍溶液1 mL和碘化鉀溶液1 mL放入棕色瓶。加入冰醋酸4 mL與水20 mL混合。使用時(shí)放入50 mL薄層色譜顯色噴霧瓶使用。

2.3 草烏葉苯提取物的分析型高效液相色譜儀分析 使用Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀對(duì)草烏葉苯提取物進(jìn)行分析。對(duì)利用制備型高效液相色譜儀初步分離和純化的草烏葉苯提取物同烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，色譜條件如下：柱子型號(hào)為Hypersil GOLD色譜柱;流動(dòng)相為乙腈∶醋酸三乙胺=33∶67;波長為235 nm;流速為1 mL/min;進(jìn)樣體積為5 μL;柱溫30 ℃。

2.4 草烏葉苯提取物制備型高效液相色譜儀（PHPLC）制備 利用制備型高效液相色譜儀對(duì)草烏葉苯提取物進(jìn)行初步的分離和精制。色譜條件如下：制備色譜柱：（規(guī)格型號(hào)：ID 50 mm×450 mm;填料信息：12 nm-S-10 μm（反相填料）;柱子數(shù)量：1套;填料名稱：日本YMC 10 μm;填裝數(shù)量：300 g;填裝柱長：250 mm;產(chǎn)品編號(hào)：GL/2014101602）;流動(dòng)相為乙腈∶水=80∶20;波長為235 nm;流速40 mL/min;進(jìn)樣量為1 mL。

利用制備型高效液相色譜儀對(duì)草烏葉苯提取物PHPLC分離產(chǎn)物峰5進(jìn)行進(jìn)一步的分離和精制。色譜條件如下：制備色譜柱：（規(guī)格型號(hào)：ID 50 mm×450 mm;填料信息：12 nm-S-10 μm（反相填料）;柱子數(shù)量：1套;填料名稱：日本YMC 10 μm;填裝數(shù)量：300 g;填裝柱長：250 mm;產(chǎn)品編號(hào)：GL/2014101602）;流動(dòng)相為乙腈∶水=50∶50;波長為235 nm;流速40 mL/min;進(jìn)樣量為1 mL。

3 結(jié)果

3.1 草烏葉苯提取物的分析 從1 kg草烏葉可得10.5 g草烏葉苯提取物。進(jìn)一步將草烏葉苯提取物進(jìn)行博層色譜分析，同時(shí)與苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿進(jìn)行比較，觀察可能存在的生物堿。結(jié)果顯示，草烏葉苯提取物經(jīng)過稀碘化鉍鉀顯色后，出現(xiàn)較多橘黃色斑點(diǎn)，說明其中含有大量生物堿類。見圖1。同時(shí)從結(jié)果可知，草烏葉苯提取物內(nèi)不含大量的次烏頭堿。另外，將草烏葉苯提取物進(jìn)樣于Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，觀察出峰情況。見圖2。

3.2 草烏葉苯提取物PHPLC分離產(chǎn)物的分析 為了得到草烏葉苯提取物的有效成分，將2 kg草烏葉提取得到的草烏葉苯提取物（共21 g）進(jìn)行制備型高效液相分離，制備得到12個(gè)不同的峰，分別命名為峰1峰、2…峰12。見圖3。將所得各個(gè)峰收集后干燥，稱取其重量，計(jì)算各峰產(chǎn)率。見表1。對(duì)所得的峰1～峰12進(jìn)行薄層色譜分析和分析型高效液相色譜分析。薄層色譜分析顯示，草烏葉苯提取物雖經(jīng)制備型液相色譜初步分離，在365 nm下觀察到較多熒光斑，說明其中的非生物堿類成分依然較多。見圖4B。但經(jīng)過稀碘化鉍鉀顯色，發(fā)現(xiàn)峰5～峰10里面的生物堿含量較多，尤其是峰7和峰9。見圖4C。峰1～峰12經(jīng)Dionex Ultimate 3000高效液相色譜分析，結(jié)果顯示，峰1～峰12與草烏葉苯提取物的圖譜比較，峰數(shù)量減少，得到初步分離。見圖5。圖5A～圖5L分別為峰1～峰12的高效液相色譜分析結(jié)果。

3.3 制備型高效液相色譜對(duì)峰5的分離和分析?? 從以上結(jié)果得知，草烏葉苯提取物中峰5～峰10含有較多生物堿。為了進(jìn)一步分析，選擇12個(gè)峰當(dāng)中的峰5為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行分離純化，也得到了12個(gè)不同峰形的分離產(chǎn)物。分別命名為峰5-1、峰5-2…峰5-12。見圖6。用薄層色譜對(duì)峰5-1～峰5-12進(jìn)行分析。同時(shí)將峰5、草烏葉苯提取物作為對(duì)照。結(jié)果顯示，峰5-1～峰5-12（圖7A 1～12，圖7B 1～12）內(nèi)的化學(xué)成分明顯少于它們的對(duì)照峰5（圖7A 13，圖7B 13）和草烏葉苯提取物（圖7A 14，圖7B 14）。另外，經(jīng)稀碘化鉍鉀顯色液顯色后可知，峰5-4的生物堿含量較多，即峰5中的生物堿集中于峰5-4。這說明，峰5經(jīng)過制備型高效液相色譜分離后，可使生物堿類集中于峰5-4。見圖7C。另外，與峰5和草烏葉苯提取物比較，各個(gè)分離產(chǎn)物在薄層板上的成分較簡單，說明達(dá)到了進(jìn)一步純化的目的。峰5-1～峰5-12也經(jīng)過了分析性高效液相色譜的分析。分析結(jié)果顯示，與峰5（圖5M）和草烏葉苯提取物（圖8N）比較，峰5-1～峰5-12（圖8A～圖8L）中的成分更加簡單，有些峰型呈單峰的趨勢(shì)，值得進(jìn)一步分離和純化。

4 討論

草烏葉是蒙藥中常用的藥材。根據(jù)學(xué)者統(tǒng)計(jì)，300多種蒙藥方劑中使用草烏葉的就達(dá)20多種。阿敏額爾敦、巴特日-7味丸、哈圖拉嘎-6味散、音達(dá)拉-15等常用蒙藥方劑中均有草烏葉的存在。文獻(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)研究顯示，這些蒙藥復(fù)方對(duì)特定疾病的治療效果較好，開發(fā)價(jià)值較大。當(dāng)然，揭示這些方劑的作用機(jī)制，就需要對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用的深入研究，更需要澄清單味蒙藥材的有效成分和藥理作用。

目前對(duì)北烏頭的研究主要集中于其干燥塊根，即草烏的研究，對(duì)草烏葉、草烏芽、草烏花的研究較少。蒙醫(yī)理論認(rèn)為，草烏葉、草烏芽、草烏花同草烏具有相同的功效，且具有小毒，使用安全性較高。因此，研究草烏葉的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用，不僅能加深人們對(duì)草烏葉本身的認(rèn)識(shí)，對(duì)于揭示含有草烏葉蒙藥復(fù)方的藥理作用和作用機(jī)制十分必要。

通過本實(shí)驗(yàn)中用用極性較小的苯作為溶劑，提取了草烏葉中極性小的化合物。分析結(jié)果顯示，提取物內(nèi)含有大量生物堿，這位我們進(jìn)一步分離其含有的生物堿類提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。但實(shí)驗(yàn)中使用了大量苯，經(jīng)濟(jì)成本高，毒性大，更不利于后期大量加工時(shí)使用。因此，對(duì)于草烏葉生物堿的提取和分離，尚需改進(jìn)提取分離方案，以利于草烏葉生物堿的大量制備。

在天然藥物化學(xué)研究當(dāng)中，分離產(chǎn)物的純度、產(chǎn)量、生產(chǎn)周期、運(yùn)行成本是應(yīng)當(dāng)考慮的因素[14]。制備型高效液相色譜具有分辨率高、檢測(cè)方便、收集產(chǎn)物準(zhǔn)確等有點(diǎn)，已經(jīng)越來越多地受到研究者的青睞[15]。本研究中，草烏葉苯提取物的分離純化只使用了制備型高效液相色譜作為分離手段，發(fā)揮了其分離時(shí)間短、效率高的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)手段為草烏葉分離產(chǎn)物的大量制備提供了便捷，為這些產(chǎn)物的藥理作用研究打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。

生物堿類往往具有很強(qiáng)的生物活性，是研究者爭相得到的化合物。在本實(shí)驗(yàn)中，草烏葉苯提取物經(jīng)制備型高效液相色譜分離后產(chǎn)生了12個(gè)可制備的峰。其中，峰7和峰9含有大量生物堿，其次為峰5、峰6、峰8、峰10。為了驗(yàn)證制備型高效液相色譜分離方法的正確性并減少樣品損失，首先選擇峰5作為研究對(duì)象，為其他各峰的分離純化奠定基礎(chǔ)。對(duì)峰5的分離后也得到了12個(gè)峰，分別被命名為峰5-1、峰5-2…峰5-12。其中，峰5-4基本涵蓋了峰5中所有的生物堿。因而確定了峰5內(nèi)草烏葉生物堿的分離工藝。如需進(jìn)一步純化其含有生物堿的單體，尚需進(jìn)一步富集。另外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，制備型液相色譜分離得到的峰7的產(chǎn)率達(dá)5.6%，且生物堿含量高，液相色譜分析表現(xiàn)出幾個(gè)明顯的單峰，研究價(jià)值很高。同時(shí)，在分離工作中還發(fā)現(xiàn)一些含有純度較高的非生物堿的分離段，如峰5-6，在今后的工作當(dāng)中可對(duì)其進(jìn)行分離。

在今后的工作當(dāng)中將進(jìn)一步純化以上分離產(chǎn)物。由于制備型高效液相色譜二次分離后，分離產(chǎn)物內(nèi)化合物種類較少，純度較高，適合使用簡單方法大量富集。置于如何精制，需進(jìn)一步研究和確定。

參考文獻(xiàn)

[1]劉沛.草烏葉藥理作用和臨床應(yīng)用分析[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（5）：141-142.

[2]烏力吉特古斯.草烏的民族醫(yī)藥學(xué)及草烏葉藥理實(shí)驗(yàn)和化學(xué)成分研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2008.

[3]柳占彪，烏力吉特古斯，王懷松，等.草烏葉抗炎作用的研究[J].天津中醫(yī)藥，2009，26（1）：75-77.

[4]烏力吉特古斯，柳占彪，王懷松，等.草烏葉總生物堿對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中草藥，2008，39（7）：1064-1065.

[5]圖雅，張貴君，劉志強(qiáng)，等.蒙藥草烏的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（7）：1581-1582.

[6]鄧廣海，林華，龔又明.草烏及其炮制品中6種生物堿類成分的含量測(cè)定[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（7）：35-38.

[7]凌珊，龔千鋒.草烏的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，23（3）：90-94.

[8]白梅榮，圖雅，巴根那，等.草烏不同藥用部位的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2009，11（11）：28-29，53.

[9]辛楊，王淑敏，劉志強(qiáng).高效液相色譜法測(cè)定草烏葉中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿[J].國外醫(yī)藥：植物藥分冊(cè)，2008，23（4）：170-171.

[10]于海蘭，賈世山.蒙藥草烏葉中一個(gè)新二萜生物堿Beiwucine[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（3）：232-234.

[11]圖雅，張貴君，王淑敏，等.草烏葉及其煎煮液中生物堿類藥效組分的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜研究[J].中國中藥雜志，2008，33（7）：789-790.

[12]李志勇，王朝魯，孫素琴，等.蒙藥草烏葉及其提取物化學(xué)成分的紅外光譜分析[J].中國中藥雜志，2011，36（23）：3281-3285.

[13]張宏，余成浩，彭成.草烏葉煎煮時(shí)間、給藥劑量與解熱功效的相關(guān)性研究[J].陜西中醫(yī)，2007，28（2）：225-226.

[14]陳鴛誼，李行諾，張翠萍，等.高效制備液相色譜在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用[J].藥學(xué)進(jìn)展，2010，34（8）：337-343.

[15]簡潔，黃建春，焦楊，等.制備液相色譜分離制備玉郎傘查爾酮類化合物[J].中草藥，2011，42（7）：1313-1316.

（2019-08-06收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81360578）

作者簡介：賽烏其日（1991.02—），男，本科，蒙藥師，研究方向：蒙藥藥理學(xué)及新藥研發(fā)相關(guān)工作，E-mail：xiangxin.jiayou@163.com

通信作者：特格喜白音（1975.12—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤分子病理學(xué)，分子蒙醫(yī)學(xué)，E-mail：tegexibaiyin@hotmail.com