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    基于ISSR-PCR的長白落葉松種子園單株遺傳多樣性分析

    2021-07-08 03:33邱新宇張含國黎家俊玉蘇普·賽迪艾合麥提胥麗雅張素芳張磊
    林業(yè)科技 2021年2期
    關(guān)鍵詞:遺傳多樣性單株

    邱新宇 張含國 黎家俊 玉蘇普·賽迪艾合麥提胥麗雅 張素芳 張磊

    摘要:? 以長白落葉松無性系種子園347個(gè)單株為試驗(yàn)材料,利用ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)分析其遺傳多樣性的結(jié)果表明,長白落葉松種子園單株具有豐富的遺傳多樣性。11條引物共擴(kuò)增出172條譜帶,其中,多態(tài)性譜帶169條,多態(tài)位點(diǎn)比率為98.26%,基因多樣性指數(shù)0.285 5,Shannon多樣性指數(shù)0.479 5~0.520 4,Nei's 指數(shù)0.064 0~0.436 0。

    關(guān)鍵詞:? ISSR;? 長白落葉松;? 單株;? 遺傳多樣性

    中圖分類號:? ?S 791. 22, S 722. 7? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:? ?A? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號:1001 - 9499(2019)02 - 0023 - 03

    長白落葉松(Larix olgensis)為松科落葉松屬,主要分布于東北林區(qū),其速生性、耐腐性和力學(xué)特性優(yōu)于其他松科植物,常作為木材工業(yè)原料使用,是我國主要的造林樹種之一。不同物種的遺傳物質(zhì)是不同的,在特定的環(huán)境條件中,通過群體的遺傳多樣性研究可以了解物種遺傳物質(zhì)的豐富程度[ 1 - 2 ]。物種的遺傳多樣性越豐富,適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng),越不容易滅絕[ 3 ]。DNA標(biāo)記是目前最有效的遺傳多樣性研究方法,其中,ISSR分子標(biāo)記簡單便捷、開發(fā)成本低,被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究中。本研究以黑龍江省林口青山林場的長白落葉松種子園為研究對象,在DNA水平上研究長白落葉松無性系種子園的遺傳多樣性,以此了解長白落葉松對環(huán)境的適應(yīng)能力,為種質(zhì)資源親緣關(guān)系的鑒別、評價(jià)和利用提供參考依據(jù)。

    1 試驗(yàn)材料與方法

    1. 1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)材料源于牡丹江林口縣青山林場,采自1994年定植的長白落葉松無性系種子園第78區(qū)的347個(gè)單株。2016年6 月下旬,采取當(dāng)年生幼嫩針葉,分袋裝好并標(biāo)記,置于冰箱-80℃冷凍保存,用于提取樣本總DNA。

    1. 2 試驗(yàn)方法

    1. 2. 1 基因組DNA提取

    使用新型植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn))提取長白落葉松樣品總DNA。

    1. 2. 2 DNA質(zhì)量檢測

    用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及紫外吸收法檢測DNA 質(zhì)量。根據(jù)DNA凝膠條帶判斷DNA的完整性,若窄帶集中,說明DNA完整性較好。利用分光光度計(jì)測定DNA濃度與純度,為保證后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行,濃度需大于200 ng/ul,OD260/OD280=1.8~2.0。將已提取的DNA模板置于-40℃冰箱保存待用。

    1. 2. 3 引物篩選

    以100條試驗(yàn)室已有引物(來源:林木遺傳育種國家重點(diǎn)試驗(yàn)室的ISSR引物,部分加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第9套ISSR引物序列)為篩選目標(biāo),隨機(jī)選取4個(gè)單株作為引物篩選樣品。

    1. 2. 4 ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

    根據(jù)PCR電泳結(jié)果選擇譜帶清晰的引物,按照落葉松ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序[ 8 - 10 ],隨機(jī)選用不同樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在1×TAE緩沖液中,將擴(kuò)增產(chǎn)物用含有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離,在紫外燈下拍攝保存記錄結(jié)果。

    1. 2. 5 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    參照電泳圖譜中分子量標(biāo)準(zhǔn),分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小,推算擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。有DNA條帶的記為“1”,無DNA條帶的記為“0”。利用 Popgene32軟件計(jì)算得到供試材料的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)、Shannon 多樣性指數(shù)等相關(guān)參數(shù)[ 11 - 12 ]。

    2 結(jié)果與分析

    2. 1 DNA質(zhì)量檢測

    由DNA 瓊脂糖檢測結(jié)果(圖1)可以看出:窄帶比較集中,提取的長白落葉松DNA樣品質(zhì)量較好,其濃度及純度均符合試驗(yàn)要求。

    2. 2 引物篩選

    根據(jù)電泳結(jié)果,選擇條帶清晰、差異明顯、重復(fù)性和穩(wěn)定性較好的引物進(jìn)行遺傳多樣性分析,從100個(gè)引物中共篩選出了11個(gè)引物,引物編號及序列見表1。

    2. 3 ISSR-PCR擴(kuò)增

    多態(tài)位點(diǎn)比率反映了群體遺傳變異水平的高低,對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的群體多態(tài)位點(diǎn)比率也比較高。利用11個(gè)引物對長白落葉松無性系347個(gè)單株的DNA 樣品進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增,共檢測到 172個(gè)位點(diǎn),位點(diǎn)范圍為100 bp~3 000 bp。每個(gè)引物平均擴(kuò)增 15.63個(gè)條帶,多態(tài)位點(diǎn)有169個(gè),多態(tài)位點(diǎn)比率高達(dá) 98.26%。其中,引物900擴(kuò)增位點(diǎn)最多,有20個(gè)位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)百分率為55%;引物854多態(tài)位點(diǎn)最少,有11個(gè)位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)百分率為63.64%。

    2. 4 單株遺傳多樣性分析

    由單株遺傳多樣性分析結(jié)果(表4)可以看出:(1)單株等位基因平均數(shù)范圍為1.000 0~2.000 0,有效等位基因數(shù)變動范圍為1.000 0~1.999 9。14、44、45號3個(gè)單株有效等位基因數(shù)最低,其值均為1.000 0,第143株有效等位基因數(shù)最高,其值為1.999 9。(2)基因多樣性指數(shù)最大為0.500 0,最小為0.000 0;Shannon指數(shù)最大為0.692 6,最小為0.000 0,單株間遺傳變異變化幅度為0.479 5~0.520 4,不同單株遺傳變異變化幅度為0.064 0~0.436 0,種群總體遺傳變異平均值為0.285 5,試驗(yàn)樣本種內(nèi)單株之間的遺傳變異明顯,群體分化強(qiáng)烈。(3)遺傳距離范圍為0.017 6~0.658 9,347個(gè)長白落葉松單株的親緣變化幅度較大。

    3 結(jié)論與討論

    本次對長白落葉松種子園單株樣本進(jìn)行ISSR標(biāo)記,共檢測到 172個(gè)位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)比率為98.26%,表明長白落葉松不同單株間相似度低、多態(tài)性高,單株之間的遺傳變異明顯,群體分化強(qiáng)烈,個(gè)體間的親緣關(guān)系變幅較大。據(jù)此可以判斷,長白落葉松種子園單株遺傳多樣性較高,可提供大量無親緣關(guān)系的優(yōu)良種子。

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    第1作者簡介:? 邱新宇(1996-),? 女,? 本科,? 研究方向:? 林木遺傳育種。

    通訊作者:? 張含國(1962-),? 男,? 教授,? 博導(dǎo),? 研究方向:? 林木遺傳育種。

    收稿日期: 2019 - 01 - 06

    (責(zé)任編輯:? ?王 巖 )

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