基于ISSR-PCR的長白落葉松種子園單株遺傳多樣性分析

邱新宇 張含國 黎家俊 玉蘇普·賽迪艾合麥提胥麗雅 張素芳 張磊

摘要：? 以長白落葉松無性系種子園347個(gè)單株為試驗(yàn)材料，利用ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)分析其遺傳多樣性的結(jié)果表明，長白落葉松種子園單株具有豐富的遺傳多樣性。11條引物共擴(kuò)增出172條譜帶，其中，多態(tài)性譜帶169條，多態(tài)位點(diǎn)比率為98.26%，基因多樣性指數(shù)0.285 5，Shannon多樣性指數(shù)0.479 5～0.520 4，Nei's 指數(shù)0.064 0～0.436 0。

關(guān)鍵詞：? ISSR;? 長白落葉松;? 單株;? 遺傳多樣性

中圖分類號：? ?S 791. 22， S 722. 7? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2019）02 - 0023 - 03

長白落葉松（Larix olgensis）為松科落葉松屬，主要分布于東北林區(qū)，其速生性、耐腐性和力學(xué)特性優(yōu)于其他松科植物，常作為木材工業(yè)原料使用，是我國主要的造林樹種之一。不同物種的遺傳物質(zhì)是不同的，在特定的環(huán)境條件中，通過群體的遺傳多樣性研究可以了解物種遺傳物質(zhì)的豐富程度[ 1 - 2 ]。物種的遺傳多樣性越豐富，適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)，越不容易滅絕[ 3 ]。DNA標(biāo)記是目前最有效的遺傳多樣性研究方法，其中，ISSR分子標(biāo)記簡單便捷、開發(fā)成本低，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究中。本研究以黑龍江省林口青山林場的長白落葉松種子園為研究對象，在DNA水平上研究長白落葉松無性系種子園的遺傳多樣性，以此了解長白落葉松對環(huán)境的適應(yīng)能力，為種質(zhì)資源親緣關(guān)系的鑒別、評價(jià)和利用提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料源于牡丹江林口縣青山林場，采自1994年定植的長白落葉松無性系種子園第78區(qū)的347個(gè)單株。2016年6 月下旬，采取當(dāng)年生幼嫩針葉，分袋裝好并標(biāo)記，置于冰箱-80℃冷凍保存，用于提取樣本總DNA。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取

使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)）提取長白落葉松樣品總DNA。

1. 2. 2 DNA質(zhì)量檢測

用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及紫外吸收法檢測DNA 質(zhì)量。根據(jù)DNA凝膠條帶判斷DNA的完整性，若窄帶集中，說明DNA完整性較好。利用分光光度計(jì)測定DNA濃度與純度，為保證后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行，濃度需大于200 ng/ul，OD260/OD280=1.8～2.0。將已提取的DNA模板置于-40℃冰箱保存待用。

1. 2. 3 引物篩選

以100條試驗(yàn)室已有引物（來源：林木遺傳育種國家重點(diǎn)試驗(yàn)室的ISSR引物，部分加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第9套ISSR引物序列）為篩選目標(biāo)，隨機(jī)選取4個(gè)單株作為引物篩選樣品。

1. 2. 4 ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

根據(jù)PCR電泳結(jié)果選擇譜帶清晰的引物，按照落葉松ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序[ 8 - 10 ]，隨機(jī)選用不同樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在1×TAE緩沖液中，將擴(kuò)增產(chǎn)物用含有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，在紫外燈下拍攝保存記錄結(jié)果。

1. 2. 5 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

參照電泳圖譜中分子量標(biāo)準(zhǔn)，分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小，推算擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。有DNA條帶的記為“1”，無DNA條帶的記為“0”。利用 Popgene32軟件計(jì)算得到供試材料的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)、Shannon 多樣性指數(shù)等相關(guān)參數(shù)[ 11 - 12 ]。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DNA質(zhì)量檢測

由DNA 瓊脂糖檢測結(jié)果（圖1）可以看出：窄帶比較集中，提取的長白落葉松DNA樣品質(zhì)量較好，其濃度及純度均符合試驗(yàn)要求。

2. 2 引物篩選

根據(jù)電泳結(jié)果，選擇條帶清晰、差異明顯、重復(fù)性和穩(wěn)定性較好的引物進(jìn)行遺傳多樣性分析，從100個(gè)引物中共篩選出了11個(gè)引物，引物編號及序列見表1。

2. 3 ISSR-PCR擴(kuò)增

多態(tài)位點(diǎn)比率反映了群體遺傳變異水平的高低，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的群體多態(tài)位點(diǎn)比率也比較高。利用11個(gè)引物對長白落葉松無性系347個(gè)單株的DNA 樣品進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，共檢測到 172個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)范圍為100 bp～3 000 bp。每個(gè)引物平均擴(kuò)增 15.63個(gè)條帶，多態(tài)位點(diǎn)有169個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比率高達(dá) 98.26%。其中，引物900擴(kuò)增位點(diǎn)最多，有20個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為55%;引物854多態(tài)位點(diǎn)最少，有11個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為63.64%。

2. 4 單株遺傳多樣性分析

由單株遺傳多樣性分析結(jié)果（表4）可以看出：（1）單株等位基因平均數(shù)范圍為1.000 0～2.000 0，有效等位基因數(shù)變動范圍為1.000 0～1.999 9。14、44、45號3個(gè)單株有效等位基因數(shù)最低，其值均為1.000 0，第143株有效等位基因數(shù)最高，其值為1.999 9。（2）基因多樣性指數(shù)最大為0.500 0，最小為0.000 0;Shannon指數(shù)最大為0.692 6，最小為0.000 0，單株間遺傳變異變化幅度為0.479 5～0.520 4，不同單株遺傳變異變化幅度為0.064 0～0.436 0，種群總體遺傳變異平均值為0.285 5，試驗(yàn)樣本種內(nèi)單株之間的遺傳變異明顯，群體分化強(qiáng)烈。（3）遺傳距離范圍為0.017 6～0.658 9，347個(gè)長白落葉松單株的親緣變化幅度較大。

3 結(jié)論與討論

本次對長白落葉松種子園單株樣本進(jìn)行ISSR標(biāo)記，共檢測到 172個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比率為98.26%，表明長白落葉松不同單株間相似度低、多態(tài)性高，單株之間的遺傳變異明顯，群體分化強(qiáng)烈，個(gè)體間的親緣關(guān)系變幅較大。據(jù)此可以判斷，長白落葉松種子園單株遺傳多樣性較高，可提供大量無親緣關(guān)系的優(yōu)良種子。

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第1作者簡介：? 邱新宇（1996-），? 女，? 本科，? 研究方向：? 林木遺傳育種。

通訊作者：? 張含國（1962-），? 男，? 教授，? 博導(dǎo)，? 研究方向：? 林木遺傳育種。

收稿日期： 2019 - 01 - 06

（責(zé)任編輯：? ?王 巖 ）