微流控芯片法在非洲豬瘟病毒核酸快速檢測(cè)中的性能分析

邵靚，陳弟詩*，陳斌，盧先東，鄧飛，張毅，劉艷紅，周莉媛，李麗

(1. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2. 寧波愛基因科技有限公司，浙江 寧波 315100)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%。目前尚無有效疫苗。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告疫病，被我國列為一類傳染病[1-2]。到目前為止，我國共發(fā)生非洲豬瘟疫情190余起，覆蓋全國31個(gè)省份。根據(jù)非洲豬瘟防控新形勢(shì)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部正在逐步建立常態(tài)化防控機(jī)制。當(dāng)前，各養(yǎng)殖企業(yè)、屠宰場(chǎng)、無害化處理場(chǎng)等場(chǎng)所，以及各級(jí)獸醫(yī)主管部門、動(dòng)物疫病防控和衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)等都在廣泛開展非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，亟需大量敏感、快速、操作簡便的檢測(cè)試劑。

微流控芯片技術(shù)是通過生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子、材料、機(jī)械等多學(xué)科交叉，將樣品前處理、分離及檢測(cè)等過程集成到幾平方厘米的芯片上，從而實(shí)現(xiàn)分析的微型化、自動(dòng)化、集成化和便攜化的技術(shù)，具有樣品消耗少、檢測(cè)速度快、操作簡便、多功能集成、體積小和便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，極大地拓展了體外診斷的應(yīng)用空間，已在分子生物學(xué)、化學(xué)分析、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[3-5]。本研究評(píng)估了微流控芯片法在ASFV核酸快速檢測(cè)中的各項(xiàng)性能，并和市場(chǎng)上的ASFV熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比對(duì)分析，為ASF的快速檢測(cè)提供了新手段，也為我省ASF的防控提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

磁珠法核酸提取試劑盒購自天隆生物科技有限公司；明日達(dá)ASFV微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒由寧波愛基因科技有限公司提供；ASFV熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.2 樣品

ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和偽狂犬病毒(PRV)培養(yǎng)物由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

ASFV臨床樣品為采集自四川養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)的豬全血、口鼻拭子、環(huán)境拭子，共43份。

1.3 病毒核酸提取

按照磁珠法核酸提取試劑盒說明書提取各檢測(cè)樣本核酸，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 微流控芯片檢測(cè)系統(tǒng)

本研究采用了預(yù)埋好特異性擴(kuò)增引物的微流控芯片(如圖1A)，擴(kuò)增靶基因?yàn)锳SFV VP72。芯片由4個(gè)獨(dú)立單元構(gòu)成，每個(gè)單元由2個(gè)加樣孔和8個(gè)反應(yīng)槽構(gòu)成，每個(gè)加樣孔與 4個(gè)反應(yīng)槽相連，但加樣孔之間以及反應(yīng)槽之間不連通。將核酸和反應(yīng)液混勻后加入加樣孔，用透明膜密封加樣孔，利用離心力定向驅(qū)動(dòng)樣本流動(dòng)進(jìn)入反應(yīng)池(圖1B，綠色部分所示)，樣本可以均勻分配到4個(gè)反應(yīng)孔；放入微流控芯片檢測(cè)儀恒溫?cái)U(kuò)增(如圖1C)；經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光讀取，信號(hào)輸出，呈現(xiàn)結(jié)果。當(dāng)待檢樣品在30 min內(nèi)擴(kuò)增出特異性曲線，判為ASFV核酸陽性；當(dāng)待檢樣品在30 min內(nèi)未擴(kuò)增出特異性曲線，判為ASFV核酸陰性。

A. 微流控芯片；B. 微流控芯片的加樣孔、微通道和檢測(cè)孔結(jié)構(gòu)；C. 微流控恒溫?cái)U(kuò)增儀

1.5 敏感性試驗(yàn)

將ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行梯度稀釋后，用ASFV微流控芯片法檢測(cè)，分析該方法的敏感性，并與熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行比較。

1.6 特異性試驗(yàn)

采用CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV培養(yǎng)物樣本，分析ASFV微流控芯片特異性，ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性對(duì)照。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

用稀釋到2.5和5×101copies/μL的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為重復(fù)性測(cè)試試驗(yàn)的樣本，用微流控芯片法和熒光定量PCR法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)8次。計(jì)算微流控芯片測(cè)得的2種濃度樣本CV值，評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣本檢測(cè)

收集43份臨床樣本，采用微流控芯片法進(jìn)行檢測(cè)，并與熒光定量PCR法進(jìn)行對(duì)比，分析結(jié)果，并計(jì)算符合率。

2 結(jié)果

2.1 ASFV微流控芯片敏感性

采用梯度稀釋的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(5×103、5×102、5×101、25、5、2.5、1.0、0.5、0.05 copies/μL)，分析ASFV微流控芯片的檢測(cè)敏感性，結(jié)果如圖2、表1所示，微流控芯片的最低檢出限是2.5 copies/μL，與市場(chǎng)上商品化的熒光定量PCR試劑盒的敏感性一致。

1～9. 分別為5×103、5×102、5×101、25、5、2.5、1.0、0.5和0.05 copies/μL

2.2 ASFV微流控芯片特異性

如圖3所示，除陽性對(duì)照出現(xiàn)明顯“S型”擴(kuò)增曲線外，其他樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該ASFV微流控芯片與其他病原無交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.3 ASFV微流控芯片重復(fù)性

用稀釋到2.5 copies/μL的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為重復(fù)性測(cè)試試驗(yàn)樣本時(shí)，3次陽性，5次陰性(圖4A、表2)，微流控芯片法和熒光定量PCR法結(jié)果一致；用稀釋到5×101copies/μL的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為重復(fù)性測(cè)試試驗(yàn)樣本時(shí)，8次結(jié)果均為陽性(圖4B、表2)，微流控芯片法和熒光定量PCR法結(jié)果一致。計(jì)算微流控芯片測(cè)得的2種濃度樣本CV值，結(jié)果表明2.5 copies/μL的測(cè)試樣本和5×101copies/μL的測(cè)試樣本的CV值分別為2.1%和2.2%(表3)，重復(fù)性良好。

表1 ASFV微流控芯片與熒光定量PCR敏感性測(cè)試結(jié)果

1. ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；2～6. 分別為CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV培養(yǎng)物

A. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度2.5 copies/μL；B. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度5×101 copies/μL

表2 ASFV微流控芯片與熒光定量PCR重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

表3 ASFV微流控芯片檢測(cè)重復(fù)性的CV值

2.4 臨床樣本檢測(cè)分析

如表4所示，微流控芯片法與熒光定量PCR法對(duì)43份臨床樣品的檢測(cè)陽性率分別為檢測(cè)結(jié)果符合率為97.67%(42/43)，不符合的1份樣本為環(huán)境拭子樣品，熒光定量PCR法檢測(cè)為陰性，而微流控芯片法為陽性。

表4 微流控芯片與熒光定量PCR對(duì)臨床樣本的檢測(cè)

3 討論

熒光定量PCR是目前生產(chǎn)實(shí)踐中用于檢測(cè)ASFV最常見的一類方法。與常規(guī)PCR相比，具有快速、敏感的特點(diǎn)，最低檢出限可達(dá)幾個(gè)到幾十個(gè)病毒拷貝。盡管如此，熒光定量PCR反應(yīng)需在不同的溫度區(qū)循環(huán)，對(duì)儀器要求高；微量加樣步驟多，對(duì)操作專業(yè)要求高；出結(jié)果時(shí)間較久；且成本也相對(duì)高昂。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法由日本學(xué)者Notomi等[6]發(fā)明，是一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，只需水浴鍋或恒溫箱等簡單設(shè)備即能開展實(shí)驗(yàn)，并通過在反應(yīng)體系中加入特殊物質(zhì)使得反應(yīng)結(jié)果肉眼可見，具有靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)時(shí)間短、臨床使用不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層部門應(yīng)用。從目前國內(nèi)學(xué)者建立的ASFV的LAMP檢測(cè)方法來看，該方法具有較高的核酸檢測(cè)敏感性以及良好的特異性[7-8]。ASFV微流控芯片檢測(cè)是在已有的LAMP擴(kuò)增基礎(chǔ)上結(jié)合Exo-NAT技術(shù)的一種新的恒溫?cái)U(kuò)増技術(shù)，擴(kuò)增時(shí)間僅需要30 min，同時(shí)敏感性提高了3～4倍，近年來得到許多研究者的青睞[9]。

本次試驗(yàn)運(yùn)用微流控芯片法和熒光定量PCR法對(duì)ASFV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、臨床樣本和其他病毒培養(yǎng)物樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明微流控芯片檢測(cè)方法的敏感性、重復(fù)性和特異性等性能不低于熒光定量PCR方法，符合對(duì)ASFV診斷的要求。在敏感性方法，ASFV微流控芯片法可實(shí)現(xiàn)2.5 copies/μL的最低檢出限；在特異性方面，該方法對(duì)CSFV、PEDV、TGEV、PCV2和PRV等5種病毒培養(yǎng)物均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)；同時(shí)，該方法具有良好的檢測(cè)重復(fù)性；運(yùn)用該方法與熒光定量PCR法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果符合率為97.67%，不符合的一份樣本檢測(cè)結(jié)果熒光定量PCR法為陰性，而微流控芯片法為陽性，提示微流控芯片法可能具有更高的檢出率。此外，由于ASFV微流控芯片法檢測(cè)時(shí)間短，不需要溫度循環(huán)，檢測(cè)儀便于攜帶和運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，特別適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層部門應(yīng)用。

本次試驗(yàn)僅對(duì)ASFV微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒及ASFV熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的某一批號(hào)做了簡要比較分析，如有條件，需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證ASFV微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒的各項(xiàng)性能，為政府監(jiān)管部門、食品生產(chǎn)企業(yè)、畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)的相關(guān)病原體檢測(cè)及監(jiān)控提供有力工具。同時(shí)，隨著微流控和基因芯片等新技術(shù)開始不斷應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域，未來ASFV病原學(xué)檢測(cè)將更加快速、準(zhǔn)確及自動(dòng)化，必會(huì)進(jìn)一步為ASF防控提供有效支持。