甜菜堿對(duì)藏雞脂肪代謝及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

姚宏,鄭玉才,李志雄,談?dòng)榔?王云浩，陳宇星,徐亞歐，向方成，饒開(kāi)晴*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041;2.成都美麗田園農(nóng)業(yè)公司，四川 彭州 611930)

甜菜堿(三甲銨乙內(nèi)脂)廣泛存在于動(dòng)植物中，具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)，且有較強(qiáng)的抗氧化性能[1]。自芬蘭科學(xué)家發(fā)現(xiàn)甜菜堿具有獨(dú)特的誘食功能后，其在水生動(dòng)物中被廣泛應(yīng)用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿不僅具有提供甲基、調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪代謝、緩解應(yīng)激、調(diào)節(jié)滲透壓等功能[3-4]，還能提高肉雞的生長(zhǎng)性能[5-6],降低肉雞腹脂率并提高其胴體品質(zhì)[7]，改善體內(nèi)脂肪代謝、促進(jìn)磷脂和載脂蛋白合成的功能，它是一種新的營(yíng)養(yǎng)再分配劑[8]。甜菜堿通過(guò)提供肉堿合成所必須的甲基從而提高生長(zhǎng)育肥豬肝臟游離肉堿的含量，促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入肌肉線粒體進(jìn)行β-氧化，減少皮下脂肪含量，同時(shí)增加肌肉脂肪含量，發(fā)揮體脂重新分配的作用[1]。研究表明，甜菜堿減少脂肪沉積的機(jī)理主要是通過(guò)為蛋氨酸的合成以及為脂肪的代謝提供甲基、參與卵磷脂合成、促進(jìn)肝脂遷移，降低肝臟和血清中甘油三酯的含量；其次，甜菜堿通過(guò)促進(jìn)肌肉和肝臟中肉堿的合成提高線粒體中脂肪的氧化，從而減少畜禽體內(nèi)脂肪的沉積[9-11]。

藏雞覓食能力強(qiáng)，耐粗放，是我國(guó)高寒、低壓及缺氧高海拔地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的重要品種資源[12]。但由于藏雞繁殖力弱，產(chǎn)蛋量低制約著藏雞的開(kāi)發(fā)利用。雞蛋形成過(guò)程中，卵黃的生成需要大量的脂質(zhì)沉積。我們之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)飼糧中添加甜菜堿能提高藏雞產(chǎn)蛋率，以及提高蛋黃中粗脂肪的含量[13]，這與脂肪代謝的改變有著密切的關(guān)系。甜菜堿可能通過(guò)影響藏雞肝臟脂肪代謝，降低體內(nèi)脂肪沉積，進(jìn)而促進(jìn)蛋內(nèi)脂肪沉積，改善藏雞的產(chǎn)蛋性能。

目前關(guān)于甜菜堿調(diào)節(jié)動(dòng)物脂肪代謝的研究多集中于豬、肉雞[14-18]，但關(guān)于藏雞飼糧中添加甜菜堿能否通過(guò)促進(jìn)脂肪酸β-氧化，調(diào)控藏雞肝臟上脂蛋白脂肪酶(liportein lipase，LPL)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)以及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARα)等關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響藏雞體脂沉積尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬研究飼糧中添加不同水平甜菜堿對(duì)藏雞脂肪代謝及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而為甜菜堿作為添加劑在藏雞飼糧中更科學(xué)地應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

選擇體重相近的180只30周齡藏雞，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。參照《中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表》(第26版)配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(表1)，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加1 000 mg/kg(低劑量組)和3 000 mg/kg(高劑量組)的甜菜堿(純度為98%，購(gòu)于天石生物有限公司)。試驗(yàn)在四川彭州市叢林藏雞種雞場(chǎng)進(jìn)行，采用籠養(yǎng)，每籠2～3只。飼養(yǎng)全期為56 d，前期1～7 d為預(yù)飼期，后期8～56 d為試驗(yàn)期，建立嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理制度。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)56 d后每個(gè)重復(fù)選取2只藏雞，頸靜脈采集血液于離心管內(nèi)，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于-20 ℃冰箱中保存。采血后屠宰，分離肝臟，液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和測(cè)定方法

1.3.1 生產(chǎn)性能的測(cè)定

于試驗(yàn)第1、56天以重復(fù)為單位稱(chēng)藏雞空腹體質(zhì)量，每天記錄藏雞飼料消耗量，用于計(jì)算其平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 腹脂率的測(cè)定

打開(kāi)腹腔分離腹部脂肪，脂肪重量由電子天平測(cè)量，腹脂率(%)=腹脂重/活體重×100%。

1.3.3 血脂及肝脂含量的測(cè)定

利用ELx800酶標(biāo)儀(BioTek)使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)肝臟、血漿中甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)含量和血漿中高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoproteins,HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(low-dendity lipoproteins, LDL-C)、游離脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)含量，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.4 肝臟中ACC、FAS、PPARα和LPL基因表達(dá)的測(cè)定

采用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取肝臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ镉山鹞ㄖ巧镉邢薰竞铣?，引物信息?jiàn)表2。以上述cDNA為模版，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析，使用TaKaRa(大連寶成生物有限公司)的TB Green TM PremixExTaqTMⅡ(Til RNase Plus)試劑盒建議的反應(yīng)體系，混合反應(yīng)物，總體積為10 μL，利用熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific-Q3)進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR反應(yīng)采用兩步法，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，退火30 s，循環(huán)40次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS(18.0)統(tǒng)計(jì)軟件中單一方差分析對(duì)生產(chǎn)性能、腹脂率、TG、TC、LDL-C、HDL-C和NEFA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；用2-ΔΔCt法對(duì)基因做相對(duì)定量表達(dá)分析，基因數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，統(tǒng)計(jì)分析前需要用Log10進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，再用單一方差分析對(duì)轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P>0.05表示無(wú)顯著差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 甜菜堿對(duì)藏雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可見(jiàn)，甜菜堿添加對(duì)藏雞的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)以及終末重均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 甜菜堿對(duì)藏雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 甜菜堿對(duì)藏雞腹脂率的影響

與對(duì)照組相比，飼糧中添加1 000 mg/kg和3 000 mg/kg的甜菜堿均顯著降低了藏雞腹脂率(P<0.05)，且高劑量組腹脂率顯著低于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 甜菜堿對(duì)藏雞血漿及肝臟中脂類(lèi)相關(guān)指標(biāo)含量的影響

與對(duì)照組相比，低、高劑量試驗(yàn)組藏雞肝臟和血漿中TG(圖2A)、TC(圖2B)的含量均顯著降低(P<0.05)，且高劑量組肝臟中TG和TC的含量顯著低于低劑量組(P<0.05)；2個(gè)試驗(yàn)組藏雞血漿中LDL-C含量(圖2C)顯著降低(P<0.05)，但低、高劑量組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；高劑量組血漿中HDL-C含量(圖2D)較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，而低劑量的甜菜堿對(duì)藏雞血漿中HDL-C含量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，不同添加水平之間也無(wú)顯著差異(P>0.05)；甜菜堿提高了藏雞血漿中NEFA含量(圖2E)，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)(P<0.05)。

注：相同字母或無(wú)字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。下同

A. TG; B. TC; C. LDL-C; D. HDL-C; E. NEFA

2.4 甜菜堿對(duì)藏雞肝臟中脂肪代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，高劑量組甜菜堿顯著降低了藏雞肝臟中ACC基因表達(dá)量(P<0.05)(圖3A)；低劑量組與高劑量組均顯著降低了藏雞肝臟中FAS基因表達(dá)量(P<0.05)，但低劑量組與高劑量組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(圖3B)；甜菜堿的添加顯著上調(diào)了藏雞肝臟中PPARα基因的表達(dá)且有劑量效應(yīng)(P<0.05)(圖3C)；LPL基因的表達(dá)量在各組間均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(圖3D)。

A. ACC; B. FAS;C. PPARα; D. LPL

3 討論

目前，甜菜堿對(duì)藏雞生產(chǎn)性能影響的研究除了本實(shí)驗(yàn)室外尚未見(jiàn)其他的研究報(bào)道。胡旭進(jìn)等[18]研究表明，飼糧中添加甜菜堿能提高金華豬的ADG。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼糧中添加甜菜堿對(duì)藏雞ADG、ADFI、F/G以及終末重均無(wú)顯著影響，這可能與藏雞對(duì)飼料的轉(zhuǎn)化率以及獨(dú)特的生存環(huán)境有關(guān)。

肉雞腹部相對(duì)于其他部位是脂肪沉積最快的地方[19]，腹脂是評(píng)判機(jī)體脂肪沉積的關(guān)鍵指標(biāo)，因其在體脂中占較大比例，直接影響體脂沉積量[20]。本試驗(yàn)中，甜菜堿降低了藏雞腹脂率，這與Saunderson等[21]報(bào)道的甜菜堿顯著降低肉雞腹脂沉積的結(jié)果較一致。Wang等[22]研究也發(fā)現(xiàn)甜菜堿顯著降低了肉鴨腹脂沉積，而且高劑量的甜菜堿減少腹部脂肪沉積效果更佳。

血清中血脂含量(TC、TG、LDL-C、HDL-C、NEFA等)可反映機(jī)體總體脂代謝狀況，如血清中TG、TC含量降低，NEFA含量升高，表明機(jī)體脂肪分解增強(qiáng)，合成減弱[23]。本試驗(yàn)中，甜菜堿降低了藏雞血漿中TC、TG、LDL-C含量，增加了藏雞血漿中NEFA含量，這與馬建爽等[24]、張冬梅等[25]的報(bào)道一致，且在本試驗(yàn)中高劑量甜菜堿的添加效果更加明顯。甜菜堿通過(guò)自身代謝循環(huán)，促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)磷脂的合成，促進(jìn)肝臟中載脂蛋白的合成，使TG的遷移速度加快，降低了血清TG的含量[26]。本試驗(yàn)中高劑量的甜菜堿組中血漿HDL-C含量升高，說(shuō)明血液運(yùn)輸膽固醇的能力增加，使血漿TC含量下降，這表明甜菜堿能夠影響肝臟的脂質(zhì)代謝，從而改變脂蛋白的比例，起到降低或重新分配體內(nèi)脂肪的作用。

FAS是組織脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[27], 能直接控制機(jī)體脂肪合成，其在肝臟中的活性可作為評(píng)判脂肪合成能力的關(guān)鍵指標(biāo)，且FAS活性與其基因mRNA表達(dá)量相關(guān)[28-29]。本試驗(yàn)中，高、低劑量甜菜堿均降低了肝臟中FAS基因的表達(dá)量，與Xing等[14]和Huang等[15]在日糧中添加甜菜堿降低肉雞和豬肝臟中FAS基因表達(dá)的研究結(jié)果一致。FAS基因表達(dá)降低，表明肝臟脂肪合成代謝減弱，證實(shí)了添加甜菜堿降低肝臟脂肪合成的能力。同時(shí)FAS基因表達(dá)下調(diào)可降低脂肪酸脂化生成TG，進(jìn)一步降低TG在脂肪組織中沉積的效率[30]。因此，在飼料中添加甜菜堿減少了藏雞腹脂沉積及降低其血漿TG含量與其下調(diào)了藏雞肝臟中FAS基因的表達(dá)密切相關(guān)。

動(dòng)物體脂沉積所需的脂肪酸大多數(shù)來(lái)自自身的脂肪酸合成，由脂肪酸合成酶催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸。ACC可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A的羧化作用，是長(zhǎng)鏈脂肪酸從頭合成的限速酶[31]。ACC既是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶又是限速酶，是脂肪酸合成與代謝中起重要作用的中間代謝物，是大多數(shù)生物脂肪酸從頭合成的第一個(gè)必需酶[32]。本研究結(jié)果顯示，藏雞飼料中添加3 000 mg/kg甜菜堿后，肝臟組織中ACC基因表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明高劑量的甜菜堿可在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)抑制肝臟脂肪合成從而控制腹脂沉積，與腹脂率顯著減少的結(jié)果是相一致的。

PPARα是調(diào)節(jié)線粒體脂肪酸β-氧化基因的主要轉(zhuǎn)錄因子[33]，能在心、肝、肌肉和腎臟中表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪的分解代謝[34]。本研究中飼糧添加低、高劑量的甜菜堿均顯著上調(diào)了藏雞肝臟中PPARα基因的表達(dá)，這與冷智賢[35]報(bào)道甜菜堿增加了肉雞肝臟中PPARα基因表達(dá)量結(jié)果一致。因此，甜菜堿可能通過(guò)提高機(jī)體線粒體脂肪酸β-氧化來(lái)調(diào)節(jié)脂肪代謝。

LPL主要是由脂肪組織和骨骼肌細(xì)胞合成分泌，它是催化脂肪組織中TG代謝的限速酶[36]，在脂蛋白代謝中起著重要作用[37]。它通過(guò)將乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的三酰甘油分解成脂肪酸和甘油，儲(chǔ)存在脂肪組織中，在不同營(yíng)養(yǎng)或生理狀態(tài)下根據(jù)組織的代謝需要來(lái)指導(dǎo)脂肪酸導(dǎo)入特異部位[38]。本試驗(yàn)中，高、低劑量甜菜堿的添加對(duì)藏雞肝臟中LPL基因表達(dá)沒(méi)有影響，這可能與甜菜堿的作用時(shí)間以及藏雞的發(fā)育階段等有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，飼糧中添加高、低劑量的甜菜堿，均能減少藏雞腹脂沉積，這可能與甜菜堿顯著下調(diào)肝臟中FAS基因、上調(diào)肝臟中PPARα基因的表達(dá)，從而顯著降低藏雞血漿中TG、TC、LDL-C的含量和增加血漿中NEAF的含量有關(guān)。本試驗(yàn)中甜菜堿的添加能夠通過(guò)抑制藏雞脂肪合成，促進(jìn)脂肪酸氧化來(lái)影響脂肪代謝，其中3 000 mg/kg甜菜堿添加效果更佳。