利用LAMP技術(shù)快速檢測(cè)羊肉制品中的鼠源性成分

陳珍金，張 璜，石 磊，葉 蕾，蔡凱賢，顏棟林，韋 濤，謝耐珍，陳小聰,*

（1.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632；2.廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510000；3.廣西東盟食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530000）

肉類摻假的歷史非常悠久，自古代起就有“掛羊頭賣狗肉”的說法[1]。時(shí)至今日，從歐洲馬肉事件到近期報(bào)道的鼠肉冒充羊肉串等羊肉制品以及假冒偽劣的牛肉等事件，“肉類摻假”不停地沖擊著食品安全體系，給社會(huì)帶來了巨大的負(fù)面影響[2-3]。其中最值得關(guān)注的是羊肉制品的鼠肉摻假事件，雖然我國(guó)的食品監(jiān)察管理部門針對(duì)鼠肉摻假等一系列問題進(jìn)行嚴(yán)格的篩查，但是我國(guó)在鑒別肉類摻假方面尚未有完善的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)察體系[1,4-5]，尤其像鼠肉這種特殊的肉源性成分，且由于肉類產(chǎn)品具有產(chǎn)品流通量大和常溫下貯藏保質(zhì)期短等特點(diǎn)[6]，在實(shí)驗(yàn)室條件下常用的定量和定性檢測(cè)方法很難滿足實(shí)時(shí)、快捷、大批量的產(chǎn)品檢測(cè)需求，因此亟需開發(fā)出快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確、便捷的肉源性成分快速檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品。

目前，對(duì)肉類制品中的種屬鑒定主要包括高效液相色譜、等電聚焦電泳和酶聯(lián)免疫測(cè)定等客觀儀器分析技術(shù)檢測(cè)方法[7-12]，但都因?yàn)槠錂z測(cè)方法靈敏度低、操作周期長(zhǎng)、操作要求高等劣勢(shì)而未被基層廣泛推廣使用。以DNA為目標(biāo)的動(dòng)物種屬鑒定是當(dāng)前普遍使用的肉類摻假分子生物學(xué)檢測(cè)方法，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測(cè)方法憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，且由于其具有高時(shí)效性和高準(zhǔn)確性，已經(jīng)逐漸取代了常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)，成為肉類種屬鑒定的主要檢測(cè)方法[13-17]。但是real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR需使用昂貴的儀器設(shè)備作為實(shí)驗(yàn)支撐，檢測(cè)成本相對(duì)較高，且反應(yīng)過程需要升降溫，導(dǎo)致該檢測(cè)技術(shù)不能很好應(yīng)用于廣大基層單位[18-19]。因此，亟待研究開發(fā)一種快速準(zhǔn)確、性價(jià)比高、恒溫且易于廣大基層單位操作的分子檢測(cè)方法，為廣大基層單位肉制品摻假診斷提供新的選擇。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為近幾年來的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR、real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測(cè)方法反復(fù)升降溫且檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)，利用BstDNA聚合酶和根據(jù)特定靶序列設(shè)計(jì)的3 對(duì)特殊的內(nèi)、外、環(huán)引物，特異性識(shí)別靶序列上的6 個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增。因其具有恒溫、特異性強(qiáng)、靈敏度高、性價(jià)比高和操作簡(jiǎn)易等特點(diǎn)[20-22]，本研究將基于LAMP檢測(cè)技術(shù)首次開發(fā)出大鼠、小鼠鼠源性檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確、易于操作的檢測(cè)目的，從而向廣大基層單位推廣使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)摻假羊肉制品中大鼠、小鼠鼠源性成分的檢測(cè)，以期為肉制品質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊、豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的動(dòng)物組織均購(gòu)自本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市。大鼠、小鼠組織由暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院提供。將羊和2 種生鮮鼠肉分別按不同質(zhì)量比例進(jìn)行混合制備模擬樣品，用于確定混合肉制品當(dāng)中鼠源性成分的檢出限。

BstDNA聚合酶 美國(guó)NEB公司；Tris、NaCl、Na2EDTA、甜菜堿 美國(guó)Sigma公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs 大連寶生物工程有限公司；動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Dhelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；Synergy UV超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；－80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

選用大鼠和小鼠的線粒體基因作為特異性基因，針對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的大鼠和小鼠的線粒體基因序列，采用BLAST對(duì)相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，確定大鼠環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）基因（KP244683.1）和小鼠的16S rRNA基因序列（KY018919.1）為保守序列，使用軟件Primer Explorer Version 4設(shè)計(jì)了LAMP引物。LAMP引物包括2 條外引物F3、B3，2 條內(nèi)引物FIB（F1c+F2）、BIP（B1c+B2）和2 條環(huán)引物FLP、BLP，分別如圖1所示，引物序列詳見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物純化方式為高效液相色譜。

表1 用于檢測(cè)鼠源性成分的LAMP引物Table 1LAMP primers used for detecting murine-derived ingredients

圖1 小鼠源性成分（A）和大鼠源性成分（B）LAMP引物設(shè)計(jì)Fig.1 Primer design for LAMP of mouse-derived (A) and rat-derived (B) ingredients

1.3.2 DNA提取

樣品DNA的提取參考廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，取適量組織樣本剪碎后置于含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行消化，后續(xù)通過對(duì)總DNA的吸附、洗滌和洗脫，最終得到純化的樣品基因組DNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，經(jīng)測(cè)定DNA的質(zhì)量濃度分布在200～300 ng/μL，采用TE溶液將DNA模板稀釋到100 ng/μL，于－80 ℃保存。

1.3.3 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道初步確定25 μL LAMP預(yù)反應(yīng)體系，其組成包括：1 mol/L甜菜堿、6 mmol/L MgSO4、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8 μmol/L FLP、0.8 μmol/L BLP、1.6 mmol/L dNTPs、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer、0.4 μmol/L SYTO-9、8UBstDNA聚合酶及2 μL模板。以雙蒸水為陰性對(duì)照，分別以大鼠、小鼠DNA模板為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行引物篩選。使用DHelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀進(jìn)行，程序設(shè)置為63 ℃、45 min。對(duì)MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶用量進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系。

1.3.4 鼠源性LAMP特異性實(shí)驗(yàn)

按照1.3.3節(jié)建立的最佳LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，以大鼠和小鼠的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以超純水作為陰性對(duì)照，以豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的DNA為特異性實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，以確定該恒溫檢測(cè)方法的特異性。

1.3.5 鼠源性LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)

以羊肉為基底肉，分別制備大鼠、小鼠不同質(zhì)量比例制備的混合模擬樣品（50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%），提取各濃度模擬樣品的DNA，按照1.3.3節(jié)所述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，以確定該恒溫檢測(cè)方法對(duì)大鼠、小鼠的檢測(cè)靈敏度。

1.3.6 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以大鼠、小鼠的檢出限濃度進(jìn)行10 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按照1.3.3節(jié)所述的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP檢測(cè)，以確定該恒溫檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。

1.3.7 實(shí)際羊肉樣品鼠源性檢測(cè)

利用本研究建立的LAMP方法與real-time PCR檢測(cè)方法針對(duì)市售的羊肉制品進(jìn)行鼠源性成分檢測(cè)，對(duì)比分析檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)并比較其實(shí)際應(yīng)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

本研究主要對(duì)MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶含量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定25 μL LAMP體系成分如下：8 mmol/L MgSO4，0.8 mol/L甜菜堿，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，環(huán)引物FLP和BLP各0.8 μmol/L，2.5 μL 10×Thermo pol Buffer，1.4 mmol/L dNTPs，10 UBstDNA聚合酶，最佳的LAMP體系反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。

表2 LAMP體系優(yōu)化篩選Table 2Optimized LAMP system

圖2 鼠源性體系優(yōu)化擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves for murine-derived ingredients under optimized conditions

2.2 鼠源性LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行大鼠和小鼠的特異性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示陰性對(duì)照和豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢等樣品DNA均未發(fā)生擴(kuò)增，僅對(duì)大鼠、小鼠樣品DNA出現(xiàn)了S型擴(kuò)增曲線，表明該恒溫檢測(cè)方法的特異性良好。

圖3 鼠源性特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Specificity analysis of LAMP for murine-derived ingredients

2.3 鼠源性LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為確定本方法的靈敏度，以羊肉為基底肉制備大鼠、小鼠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%的混合肉樣品，進(jìn)行DNA提取后進(jìn)行LAMP檢測(cè)。結(jié)果表明，大鼠源性成分的檢測(cè)靈敏度為0.1%；小鼠源性成分的檢測(cè)靈敏度為0.5%，結(jié)果如圖4所示。

圖4 大鼠（A）和小鼠（B）源性成分的檢測(cè)靈敏度Fig.4 Sensitivity analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

2.4 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為確定該方法的檢測(cè)穩(wěn)定性，對(duì)大鼠的檢出限0.1%，小鼠的檢出限0.5%各設(shè)置10 個(gè)平行，進(jìn)行LAMP檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法具有良好的穩(wěn)定性。

圖5 鼠源性檢測(cè)方法0.1%大鼠（A）和0.5%小鼠（B）重復(fù)性Fig.5 Repeatability analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

2.5 實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果

用建立的LAMP檢測(cè)方法和real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)49 份市售羊肉制品進(jìn)行檢測(cè)，如表3所示。本研究的LAMP檢測(cè)方法與real-time PCR方法特異性為100.00%，靈敏度為100.00%，總符合率為100.00%。由于目前檢測(cè)陽(yáng)性樣本數(shù)較少，需后續(xù)增加樣本數(shù)判斷2 種方法的一致性。

表3 鼠源性成分的LAMP和real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果Table 3Results of LAMP and real-time PCR for murine-derived ingredients adulterated in real samples

3 討 論

在利益的驅(qū)動(dòng)下，市面上肉制品摻假行為時(shí)有發(fā)生，自從“歐洲馬肉”事件曝光以來，肉制品摻假逐漸成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題[23-25]。隨著時(shí)間的推移和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，肉制品鑒偽領(lǐng)域的檢驗(yàn)技術(shù)日益完善。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)逐漸成為食品檢驗(yàn)領(lǐng)域監(jiān)管的有效手段，基于PCR和real-time PCR的羊、牛、豬、鴨等動(dòng)物源性快速檢測(cè)技術(shù)已日趨成熟，并逐步進(jìn)入國(guó)內(nèi)外檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。然而，使用鼠肉假冒羊肉違法行為被揭露的時(shí)間較短，而且，如今LAMP技術(shù)在肉制品摻假領(lǐng)域還沒有成熟的標(biāo)準(zhǔn)可供應(yīng)用。因此，國(guó)內(nèi)外使用LAMP技術(shù)進(jìn)行鼠源性成分定性和定量檢測(cè)鮮有報(bào)道。目前，李欣南[1]使用PCR、電泳檢測(cè)、LAMP等方法對(duì)小白鼠鼠源性成分進(jìn)行檢測(cè)；Suryawan等[28]基于PCR對(duì)牛肉丸子的大鼠肉摻假進(jìn)行檢測(cè)。而基于快速、靈敏、準(zhǔn)確的LAMP技術(shù)建立的食品中大鼠和小鼠源性成分定性、定量檢測(cè)方法鮮見有報(bào)道。

本研究設(shè)計(jì)了用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分鑒定的LAMP引物，擬建立鼠源性成分的定性檢測(cè)方法，基于鼠線粒體基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，與核DNA相比，線粒體DNA因?yàn)槠洫?dú)特的遺傳方式和多拷貝而具有靈敏度高的特點(diǎn)，因此，線粒體DNA被廣泛用于國(guó)內(nèi)外飼料、生鮮及肉制品的來源追蹤和食品中動(dòng)物源性成分的鑒別以及摻假肉類的定性、定量檢測(cè)[29-34]。本研究以大鼠COX基因（KP244683.1）和小鼠的16S rRNA基因（KY018919.1）作為目的基因設(shè)計(jì)LAMP引物，開發(fā)出鼠源性成分LAMP檢測(cè)體系。結(jié)果表明，本研究建立的LAMP方法具有較好的特異性，大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.1%和0.5%，對(duì)市售羊肉制品的恒溫檢測(cè)和real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，總符合率為100.00%。

與李欣南[1]使用PCR、電泳檢測(cè)和LAMP等對(duì)鼠源性成分進(jìn)行檢測(cè)方法相比，本研究建立的LAMP方法分別對(duì)大鼠和小鼠2 種鼠源性成分進(jìn)行研究，而李欣南[1]僅針對(duì)小白鼠展開鼠源性檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)對(duì)象方面本實(shí)驗(yàn)建立的鼠源性檢測(cè)方法覆蓋面更廣。與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)在確保檢測(cè)方法特異性的前提下，將鼠源性檢測(cè)的靈敏度提高了1 個(gè)數(shù)量級(jí)；同時(shí)，通過10 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，本研究建立的鼠源性成分檢測(cè)方法具有更高的穩(wěn)定性。因此，本研究建立的鼠源性LAMP檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性良好、操作簡(jiǎn)單、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)。補(bǔ)充和完善了鼠源性檢測(cè)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，適用于基層檢測(cè)單位或現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，實(shí)用性強(qiáng)，具有良好的研究、推廣價(jià)值和應(yīng)用前景。