油松花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基及花粉貯藏條件研究

于慶福

(喀左縣林業(yè)種苗技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 喀左 122300)

油松Pinustabulaeformis為松科松屬常綠喬木，我國特有樹種。針葉深綠色，2針1束，雌雄同株，花期為每年的4-5月，球果翌年10月成熟。油松為喜光、深根性樹種，喜干冷氣候，在土層深厚、排水良好的酸性、中性或鈣質(zhì)黃土上均能生長良好[1]。油松為我國北方地區(qū)重要的用材樹種之一，也是水土保持和城鄉(xiāng)綠化的重要樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。

在開展油松雜交育種和油松種子園控制授粉等工作中，常進(jìn)行花粉貯藏和生活力測(cè)定，這樣可避免無活力花粉的使用，否則將導(dǎo)致雜交計(jì)劃的失敗[2-3]。因此一種有效的花粉生活力檢測(cè)方法及花粉貯藏條件的探索，對(duì)確保油松雜交和控制授粉的成功具有重要意義。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選適合油松花粉萌發(fā)的離體培養(yǎng)基，并對(duì)不同貯藏溫度及時(shí)間的油松花粉生活力進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)價(jià)，為油松人工授粉和雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

油松雄花序于2019年5月6日采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園。

1.2 方 法

1.2.1 花粉采集

采集發(fā)育正常即將散粉的油松雄花序，裝入袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集回來的雄花序平鋪在硫酸紙上，放置24 h，待其散粉后，用鑷子夾住花序輕輕將花粉抖落，篩除雜質(zhì)后備用。

1.2.2 花粉貯藏

將花粉分別裝入1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記，然后將裝有花粉的離心管分別在常溫(25 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃條件下各貯藏10管。

1.2.3 花粉萌發(fā)離體培養(yǎng)基的篩選

以采集的油松新鮮花粉為試材，采用L9(34)正交表進(jìn)行培養(yǎng)基篩選，因素和水平見表1，研究蔗糖、硼酸和pH值3個(gè)因素不同水平對(duì)油松花粉離體萌發(fā)的影響。培養(yǎng)基均添加瓊脂8 g·L-1，培養(yǎng)基制好后倒在直徑100 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基厚度3 mm，待自然冷卻至室溫后，將花粉均勻地撒在培養(yǎng)基上，蓋上蓋，置于(25±1)℃ 培養(yǎng)室中培養(yǎng)72 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉的萌發(fā)情況。觀察顯示：培養(yǎng)24 h的油松花粉無明顯萌發(fā)跡象；培養(yǎng)48 h的油松花粉雖已萌發(fā)，但不適于觀察和統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率；培養(yǎng)72 h的油松花粉完全萌發(fā)，便于觀察和統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。以花粉管的長度超過花粉粒直徑的1.5倍為花粉萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)培養(yǎng)皿取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)其平均萌發(fā)率，重復(fù)4次。通過極差分析和方差分析篩選適宜油松花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

1.2.4 不同貯藏條件對(duì)花粉生活力的影響

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基測(cè)定油松初始萌發(fā)率后，將油松花粉分別放在-80 ℃、-20 ℃、4 ℃和25 ℃ 條件下貯藏，待花粉在4種溫度條件下貯藏15 d、30 d后，各取出1管，在優(yōu)化的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，72 h后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，S-N-K法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)離體培養(yǎng)基的篩選

由表2可知，蔗糖的R值最大，pH值的R值最小，說明此試驗(yàn)設(shè)計(jì)下蔗糖不同質(zhì)量濃度對(duì)油松花粉萌發(fā)的影響最大，其次是硼酸，影響最小的是pH值；從平均值來看，蔗糖質(zhì)量濃度的第1水平最好，硼酸質(zhì)量濃度的第2水平最好，pH值的第2水平最好，說明最佳培養(yǎng)基是蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1，pH值6.5。

表2 油松花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基篩選的極差分析

由表3可知，在該試驗(yàn)條件下，蔗糖和硼酸兩個(gè)因素不同水平對(duì)油松花粉萌發(fā)的影響均達(dá)到極顯著水平，pH值不同水平對(duì)油松花粉萌發(fā)的影響不顯著。

表3 油松花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基篩選的方差分析

由表4可知，蔗糖100 g·L-1對(duì)油松花粉萌發(fā)的效果最好，150 g·L-1的效果次之，200 g·L-1的效果最差，且三者間差異均達(dá)到了極顯著水平；硼酸0.1 g·L-1的效果最好，0.2 g·L-1的效果次之，0.05 g·L-1的效果最差，0.1 g·L-1和0.05 g·L-1花粉萌發(fā)率的差異達(dá)到極顯著水平；但0.1 g·L-1與0.20 g·L-1、0.20 g·L-1與0.05 g·L-1對(duì)花粉萌發(fā)率的影響均未達(dá)到極顯著水平；不同pH值對(duì)油松花粉萌發(fā)的影響未達(dá)到顯著水平。

表4 油松花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基篩選的多重比較

根據(jù)極差分析、方差分析和多重比較結(jié)果，篩選出油松花粉萌發(fā)的離體培養(yǎng)基為蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值6.5，該培養(yǎng)基位于設(shè)計(jì)的第二個(gè)組合，測(cè)定油松新鮮花粉萌發(fā)率為93.12%，即花粉貯藏前的初始萌發(fā)率為93.12%。

2.2 不同貯藏條件對(duì)花粉生活力的影響

由表5可知，-80 ℃條件下油松花粉貯藏15 d和30 d后萌發(fā)率分別為92.93%和91.27%，兩者與新鮮花粉的萌發(fā)率差異不顯著；-20 ℃條件下花粉貯藏15 d和30 d的萌發(fā)率分別為92.24%和88.65%，其中貯藏30 d后的萌發(fā)率與新鮮花粉的萌發(fā)率差異達(dá)到極顯著水平；4 ℃條件下花粉貯藏15 d和30 d后的萌發(fā)率分別為90.69%和86.84%，貯藏30 d后的萌發(fā)率與新鮮花粉的萌發(fā)率差異達(dá)到極顯著水平；25 ℃條件下貯藏15 d和30 d的萌發(fā)率分別為90.27%和82.66%，與新鮮花粉萌發(fā)率差異均達(dá)到極顯著水平。

表5 4種貯藏溫度下花粉萌發(fā)率的多重比較 %

3 討論與結(jié)論

沈靜華等研究蔗糖質(zhì)量濃度和硼酸質(zhì)量濃度對(duì)油松花粉生活力的影響時(shí)，得出在蔗糖10%+硼酸0.01%的固體培養(yǎng)基上，油松新鮮花粉萌發(fā)率可達(dá)98.6%[4]。本研究首次采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過統(tǒng)計(jì)分析得出適宜油松花粉萌發(fā)的離體培養(yǎng)基為蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值6.5，新鮮花粉的萌發(fā)率為93.12%，篩選的固體培養(yǎng)基在蔗糖質(zhì)量濃度和硼酸質(zhì)量濃度上與沈靜華等的結(jié)論一致；同時(shí)本試驗(yàn)中蔗糖為油松花粉萌發(fā)的最主要影響因子，蔗糖質(zhì)量濃度為100 g·L-1的油松花粉萌發(fā)率最高，與周強(qiáng)等研究樟子松花粉適宜萌發(fā)培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度也一致[5]。

不同溫度貯藏的油松花粉，隨貯藏時(shí)間延長，生活力降低；貯藏溫度越低，花粉生活力下降得越緩慢，貯藏溫度越高，花粉生活力下降就越快。這是因?yàn)榛ǚ圪A藏過程中保持較低溫度，能夠使花粉代謝受到抑制，酶活性減弱，呼吸作用降低，從而能夠使花粉長時(shí)間地維持生活力，這一結(jié)論與吳月亮等[6]、張慧會(huì)等[7]、Wang等[8]對(duì)花粉生活力與貯藏性的研究結(jié)論一致。

本項(xiàng)研究中油松花粉在4種溫度下貯藏30 d，均能保持較高生活力，對(duì)開展油松授粉解決花期不遇和異地運(yùn)輸?shù)葧r(shí)空問題具有重要的實(shí)際意義。