雙基因突變型X連鎖Alport綜合征女性患者臨床與遺傳學(xué)特征分析

胡寧寧 戴選彤 蔣更如 林芙君 寧 燕

Alport綜合征(Alport syndrome，AS)是一種臨床上較為常見的遺傳性腎小球疾病，以腎性血尿、進(jìn)行性腎功能減退為主要臨床表現(xiàn)，部分患者合并感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss, SNHL)和眼部異常[1]。AS的病因?yàn)榫幋aⅣ型膠原α3、α4、α5鏈的基因COL4A3、COL4A4、COL4A5發(fā)生突變導(dǎo)致腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)出現(xiàn)彌漫變薄、厚薄不均、致密層撕裂、分層或蟲蝕樣等改變，部分患者以局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)為特征性病理學(xué)改變。以往認(rèn)為，AS為罕見病(患病率約1/5 000～1/10 000)，分為COL4A5基因突變所導(dǎo)致的X連鎖顯性遺傳型AS(XLAS，約占80%～85%)，以及COL4A3基因、COL4A4基因突變導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳型AS(ARAS，約占10%～15%)或常染色體顯性遺傳型AS(ADAS，約占5%)。隨著二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)技術(shù)在臨床應(yīng)用的普及，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變檢出率顯著增高，尤以COL4A3、COL4A4、COL4A5基因雜合突變?yōu)橹?。需關(guān)注的是，部分COL4A3、COL4A4、COL4A5基因雜合突變型患者并非均預(yù)后良好，約15%的患者在中老年期進(jìn)展至終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)。因此，越來越多的學(xué)者呼吁基于AS的發(fā)病機(jī)制，將所有攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5基因致病突變的患者統(tǒng)一診斷為AS[2-5]，以強(qiáng)調(diào)對(duì)所有患者進(jìn)行早期診斷，啟動(dòng)早期的腎臟保護(hù)治療。按照該定義，AS患者在成人CKD和兒童CKD患者中分別約占3%[6]和1%～2%[7]，是CKD的重要病因之一。

XLAS女性患者多數(shù)攜帶COL4A5基因雜合突變，此類患者存在較為顯著的臨床異質(zhì)性，且無明顯的基因型-臨床表型關(guān)聯(lián)[8]。僅約1/3的XLAS女性患者在病程中始終為孤立性腎性血尿，72.6%合并不同程度蛋白尿，15.5%在65歲前進(jìn)展至ESRD，少部分患者甚至在40歲前即進(jìn)展至ESRD[8]。XLAS女性患者GBM病變的差異較大，部分可表現(xiàn)為正?；蛴芯衷罨驈浡宰儽?，常缺乏AS的GBM特征性病理學(xué)改變[9]。目前已知可導(dǎo)致XLAS女性患者臨床表現(xiàn)差異的機(jī)制有：X染色體隨機(jī)失活[10],攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變，同時(shí)攜帶非COL4A類(如MYO1E、MYH9、LAMA5等)基因突變[11-13]或修飾基因NPHS2多態(tài)性位點(diǎn)(p.R229Q)[14]、合并IgA腎病等原發(fā)性腎小球疾病，以及環(huán)境因素等。

自2015年Mencarelli等[15]首次報(bào)道11例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型AS患者以來，國(guó)內(nèi)外相繼有文獻(xiàn)對(duì)此類較為特殊的AS患者進(jìn)行報(bào)道。截至目前，共報(bào)道34例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型AS患者[8, 15-23]，其中XLAS女性患者僅10例，在所有XLAS女性患者中約占0.3%～1.0%[8，19]。本研究旨在通過回顧性分析3例經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院?jiǎn)沃行脑\治的COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者，同時(shí)匯總分析既往已報(bào)道的10例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者[8, 15-19]的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)表型和基因突變特點(diǎn)，進(jìn)一步加深臨床醫(yī)師對(duì)該特殊類型XLAS女性患者疾病的認(rèn)識(shí)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2019年1月—2020年12月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院就診并經(jīng)基因檢測(cè)明確診斷的3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者及其家系內(nèi)患病成員的臨床資料、腎臟病理和基因檢測(cè)結(jié)果。本研究對(duì)樣本和病史的采集遵守聯(lián)合國(guó)教育科學(xué)和文化組織制訂的《人類基因組宣言》，并獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：XHEC-D-2020-005)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

用“Alport syndrome”“X-linked”“COL4A5” “COL4A3”“COL4A4”“female”“digenic”“thin basement membrane nephropathy”“focal segmental glomerulosclerosis”等關(guān)鍵詞, 在PubMed、Embase、The Cochrane Library數(shù)據(jù)庫中檢索既往文獻(xiàn)報(bào)道的COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者。

1.2 臨床資料整理與分析 整理3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者的歷次住院病史資料和門診隨訪資料，包括性別、發(fā)病年齡、臨床癥狀、腎臟疾病家族史、血尿和尿蛋白水平、腎功能指標(biāo)、CKD和ESRD的進(jìn)展速度、治療情況，以及出現(xiàn)高頻SNHL和眼部病變(前圓錐形晶狀體、黃斑周圍點(diǎn)狀和斑點(diǎn)狀視網(wǎng)膜病變等)的腎外表現(xiàn)情況。既往曾行腎臟穿刺活組織病理學(xué)檢查(簡(jiǎn)稱活檢)的患者，對(duì)其病理資料進(jìn)行重新閱片，閱片內(nèi)容包括光學(xué)顯微鏡(簡(jiǎn)稱光鏡)、免疫熒光顯微鏡、電子顯微鏡(簡(jiǎn)稱電鏡)下拍攝的腎組織和皮膚基底膜形態(tài)及其Ⅳ型膠原α3、α5免疫熒光染色情況。詳細(xì)詢問患者的其他家系成員病史，并對(duì)可獲取樣本的家系成員進(jìn)行尿常規(guī)和腎功能檢查。采集先證者及其家系成員外周血樣本保存于含乙二胺四乙酸(EDTA)的試管中。

對(duì)搜索文獻(xiàn)并整理的10例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者的臨床表現(xiàn)和基因突變特點(diǎn)進(jìn)行整理和歸納。

1.3 基因組DNA提取和鑒定 采用離心柱型血液基因組DNA提取試劑[TIANamp Blood DNA Kit，天根生化科技(北京)有限公司]提取研究對(duì)象外周靜脈血中的基因組DNA，應(yīng)用NANODROP 2000核酸檢測(cè)儀對(duì)DNA原液進(jìn)行定量和純度分析。

1.4 全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing，WES) 對(duì)3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者進(jìn)行WES，全外顯子捕獲芯片采用Agilent SureSelect Human All Exon V5試劑盒(安捷倫科技有限公司)，有效覆蓋區(qū)域?yàn)?0 Mb。

1.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)WES檢出的與臨床相符的致病或可能致病的COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)引物，采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。驗(yàn)證該位點(diǎn)在家系患病成員和其他成員中是否與疾病表共分離。查詢?nèi)R頓開放變異數(shù)據(jù)庫(Leiden open variation database, LOVD；https://databases.lovd.nl/shared/variants/COL4A)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database，HGMD；http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.php)，明確上述共分離突變位點(diǎn)是否被收錄。如發(fā)現(xiàn)的COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變?yōu)槲丛鴪?bào)道的新突變，進(jìn)一步通過對(duì)120例性別、年齡匹配的漢族健康志愿人群進(jìn)行Sanger測(cè)序明確其人群頻率，并參照2015年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)突變指南[24]，應(yīng)用Polyphen2、SIFT、MaxEntScan、NNSPLICE、Human Splicing Finder、SpliceSiteFinder、GeneSplicer預(yù)測(cè)軟件[25]評(píng)估突變位點(diǎn)的致病性。

2 結(jié) 果

2.1COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者的基因突變特點(diǎn)與臨床特征分析

2.1.1 基因突變特點(diǎn) 如表1和表2所示，本研究3例XLAS女性患者中，1例攜帶COL4A3和COL4A5雙基因雜合突變，2例攜帶COL4A4和COL4A5雙基因雜合突變。共發(fā)現(xiàn)6種COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變，均為錯(cuò)義突變(有3種為甘氨酸突變?yōu)槠渌被?；其中，3種位于非膠原結(jié)構(gòu)域(noncollagenous-1 domain, NC1)，2種位于三螺旋膠原結(jié)構(gòu)域(triple-helical collagenous domain)，1種位于氨基端7s結(jié)構(gòu)域。除COL4A5(c.3500G>A；p.Gly1167Asp)突變?yōu)橐褕?bào)道的致病突變外，其余5種均為新突變。

2.1.2 臨床特征 如表1所示，3例XLAS女性患者均以鏡下血尿或肉眼血尿發(fā)病，發(fā)病年齡為(7.33±2.08)歲；3例患者均有不同程度蛋白尿，24 h尿蛋白定量(0.45±0.21) g，出現(xiàn)蛋白尿的年齡為(9.33±1.15)歲。1例患者于40歲時(shí)進(jìn)展為ESRD，其余2例患者目前腎功能處于正常范圍。3例患者經(jīng)聽力與眼部檢查均未發(fā)現(xiàn)高頻SNHL、前圓錐形晶狀體等AS特征性腎外表現(xiàn)。1例患者在9歲時(shí)曾行腎臟穿刺活檢，光鏡下見局灶節(jié)段性系膜增生；電鏡下未見GBM明顯異常，合并足突節(jié)段性融合，免疫熒光染色Ⅳ型膠原α3、α5未見異常。2例患者在出現(xiàn)微量蛋白尿時(shí)給予RAS抑制劑(renin-angiotensin system inhibitors，RASI)治療，1例患者就診時(shí)已進(jìn)展至ESRD并接受腎臟替代治療。

表1 3例攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變的XLAS女性患者及其家系的臨床特征和基因突變情況

在搜索文獻(xiàn)得到的10例女性患者中(臨床表現(xiàn)和基因突變特點(diǎn)見表2)，4例為東亞人種，2例為高加索人種，4例種族不詳。其中，6例患者同時(shí)攜帶COL4A3和COL4A5基因雜合突變，3例患者同時(shí)攜帶COL4A4和COL4A5基因雜合突變，1例患者同時(shí)攜帶COL4A3、COL4A4和COL4A5基因雜合突變。10例患者均發(fā)病較早且合并不同程度蛋白尿，其中2例患者分別于40、44歲進(jìn)展至ESRD。3例患者合并腎外表現(xiàn)(2例合并SNHL，1例同時(shí)合并SNHL和眼部病變)。

對(duì)本研究中3例患者進(jìn)行家系內(nèi)調(diào)查后共發(fā)現(xiàn)9例家系內(nèi)患病成員，其中7例經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5單基因突變。相較其中僅攜帶COL4A5突變的XLAS女性患病成員，COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者具有發(fā)病早、合并蛋白尿和腎功能受損比例高的特點(diǎn)。見表2和圖1。

A為家系1 B為家系2 C為家系3圖1 3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者家系圖

表2 本研究和既往已報(bào)道的13例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者的臨床特征與基因突變類型

3 討 論

隨著NGS在臨床的普及，多基因遺傳模式在遺傳性腎臟病中陸續(xù)被報(bào)道[26-28]，且不同基因突變對(duì)疾病嚴(yán)重程度存在協(xié)同作用。除AS外，其他遺傳性腎臟疾病如先天性腎病綜合征(NPHS1和NPHS2雙基因突變)[26]、常染色體顯性多囊腎病(PKD1和PKD2雙基因突變)[27]，以及Bartter綜合征(CLCNKA和CLCNKB雙基因突變)[28]等亦有雙基因遺傳模式被報(bào)道。2015年Mencarelli等[15]首次報(bào)道了11例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型AS患者，并提出AS可能存在雙基因遺傳模式，且該特殊遺傳模式有助于解釋同一家系中不同患者臨床癥狀嚴(yán)重程度的差異。同時(shí)該研究[15]指出，攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變的患者臨床表型嚴(yán)重程度可能介于ADAS與ARAS之間。2019年，Zhang等[19]報(bào)道了首例COL4A3、COL4A4、COL4A5三基因突變型XLAS女性患兒。之后陸續(xù)有文獻(xiàn)對(duì)此類患者進(jìn)行報(bào)道。

截至目前，共有10例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者被報(bào)道，其中6例患者同時(shí)攜帶COL4A3和COL4A5基因雜合突變，3例患者同時(shí)攜帶COL4A4和COL4A5基因雜合突變，1例患者同時(shí)攜帶COL4A3、COL4A4和COL4A5基因雜合突變。與本研究新發(fā)現(xiàn)的3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者類似，這10例患者均發(fā)病較早且合并不同程度蛋白尿，其中2例患者分別于40、 44歲時(shí)進(jìn)展至ESRD，3例患者合并腎外表現(xiàn)。由此可見，COL4A3、COL4A4、COL4A5多基因遺傳是影響XLAS女性患者臨床表型嚴(yán)重程度的重要因素。此外，XLAS女性患者如同時(shí)攜帶非COL4A類基因突變，如MYO1E基因(c.2627C>G;p.Thr876Arg)[11]、MYH9基因(c.4952T>C;p.Met1651Thr)[12]、LAMA5基因(c.3728C>T;p.Pro1243Leu)[13]突變或基因多態(tài)性位點(diǎn)，如NPHS2基因(c.686G>A;p.Arg229Gln;rs61747728)[14]，亦可加重腎臟臨床表型，并導(dǎo)致腎外表現(xiàn)如高頻SNHL[12]。

雖然，目前尚無已應(yīng)用于臨床的AS精準(zhǔn)靶向治療方法，但多項(xiàng)回顧性研究[29-30]和前瞻性研究[31]均已證實(shí)RASI對(duì)AS具有確切的腎臟保護(hù)作用。RASI治療可使攜帶非截短型COL4A5基因突變患者和截短型COL4A5基因突變患者進(jìn)展至ESRD的時(shí)間分別延遲17、12年[32]。2013年版AS治療指南推薦[33]，AS患者應(yīng)在出現(xiàn)微量白蛋白尿或顯性蛋白尿時(shí)開始接受RASI治療。2020年，一項(xiàng)名為“Early Prospective Therapy European Community Trial Alport(EARLY PRO-TECT Alport)”的Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，AS患者在出現(xiàn)微量蛋白尿之前使用雷米普利治療能有效延緩蛋白尿的進(jìn)展和腎小球?yàn)V過功能的下降[31]。據(jù)此，Kashtan等[5]建議，XLAS男性患者和ARAS患者在確診時(shí)就應(yīng)開始接受治療。本研究中的2例雙基因突變型XLAS女性患者在出現(xiàn)微量蛋白尿時(shí)即給予RASI治療。目前對(duì)于COL4A3、COL4A4和COL4A5基因雜合突變患者何時(shí)啟動(dòng)RASI治療尚無大樣本前瞻性研究[34-35]，有待今后開展隨機(jī)對(duì)照研究予以明確。

本研究為單中心回顧性研究，納入的3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者數(shù)量占本中心45例XLAS女性患者的6.7%，高于先前文獻(xiàn)報(bào)道的1%，這可能與本中心使用NGS技術(shù)進(jìn)行基因檢測(cè)有關(guān)。今后可利用NGS技術(shù)開展多中心前瞻性研究以更好地了解該類患者在XLAS女性患者中的比例。

結(jié)合本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，值得關(guān)注的是，AS已成為CKD的重要病因之一；同時(shí)，AS患者中除XLAS男性患者外，其他包括XLAS女性患者可存在臨床表型與基因表型關(guān)聯(lián)性欠佳，起病可隱匿，或以單純血尿和蛋白尿發(fā)病，臨床癥狀輕重不一，典型的腎外損傷表現(xiàn)可缺如，相當(dāng)部分患者可出現(xiàn)腎功能減退等特點(diǎn)。這對(duì)我國(guó)CKD的防治管理工作提出了挑戰(zhàn)。上海作為全國(guó)老齡化程度較高的城市，CKD對(duì)上海人口健康水平和生活質(zhì)量的威脅較為嚴(yán)重。故筆者認(rèn)為，應(yīng)對(duì)CKD的高危人群(如XLAS女性患者)，一方面應(yīng)施行疾病檢測(cè)端口的前移以充實(shí)疾病基因樣本庫，另一方面可采用問卷調(diào)查和線上講座等形式加強(qiáng)基層醫(yī)師對(duì)相關(guān)疾病的認(rèn)知，并且通過有效的科普宣傳模式提高社區(qū)居民的CKD自我防范意識(shí)，以促進(jìn)疾病的早期預(yù)防。

綜上所述，COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者發(fā)病早、合并蛋白尿和腎功能受損比例高，提示多基因遺傳是影響XLAS女性患者臨床異質(zhì)性的重要因素。對(duì)臨床表現(xiàn)重和腎功能損害進(jìn)展快的XLAS女性患者需考慮存在多基因遺傳可能，并可運(yùn)用NGS技術(shù)檢測(cè)予以明確。