兒童急性淋巴細(xì)胞白血病抑癌基因ID4甲基化狀態(tài)及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系

趙麗麗 丁顯春 向金峰 張 嫻 牛文忠

白血病是由于基因組發(fā)生變化而導(dǎo)致的造血干/祖細(xì)胞疾病，主要特征為大量異常造血細(xì)胞惡性增殖、凋亡減少、分化受阻，正常血細(xì)胞明顯減少等[1-2]。急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是小兒白血病中最常見的類型，多發(fā)病于小兒，屬于造血干細(xì)胞異常而導(dǎo)致的克隆性疾病，其特點(diǎn)是高度異質(zhì)性、分化差異性大[3]。目前AML的發(fā)病原因和機(jī)理尚未完全明確，臨床上只有部分患兒能夠通過傳統(tǒng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型法得以準(zhǔn)確分型，為此很難判斷病情與預(yù)測(cè)預(yù)后[4]。DNA結(jié)合抑制因子4(inhibitor DNA binding 4，ID4)屬于顯性負(fù)相螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子亞家族，能激活下游與細(xì)胞分化增殖等有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[5]。ID4在正常人骨髓中為完全非甲基化狀態(tài)，但是在血液腫瘤患者中可呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。ID4編碼基因位于6p22-21號(hào)染色體上[6]，主要表達(dá)于大腦、甲狀腺組織中。ID4基因啟動(dòng)子最核心的部位在-48到+32，位于TATA盒下游[7]。此部位包含了sp3基序、E-box盒、sp1基序，其中sp1和sp3是負(fù)性調(diào)控元件，E-box盒是正性調(diào)控作用。ID4基因啟動(dòng)子區(qū)富含CpG島，ID4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8-9]。甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MS-PCR)是一種測(cè)定CpG島CpG甲基化的重要方法，當(dāng)前在臨床上的應(yīng)用比較廣泛。本研究采用MS-PCR方法，探討了兒童ALL抑癌基因ID4甲基化狀態(tài)及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系，并探索了ID4甲基化狀態(tài)對(duì)ALL預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1月到2020年1月選擇在本院診治的ALL患兒80例作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：符合AML的診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡2～12歲；臨床資料完整，能夠配合完成本次研究者；本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：有智力或精神障礙不能配合者；合并其他惡性腫瘤者；嚴(yán)重心、肝、腎等功能障礙者；臨床資料缺乏者。根據(jù)病情程度分為慢性期32例，加速期28例，急變期20例。不同分期患兒的性別、年齡、體重、身高、T/B分型等對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同病情程度分期患兒的一般資料對(duì)比

1.2 ID4甲基化檢測(cè)

取所有患兒的外周靜脈血，提取基因組DNA，溶于水中-20 ℃保存。采用MS-PCR進(jìn)行錯(cuò)增，ID4甲基化上游引物：5′-TTTTATAAGGGCAGCTTGTTGGC-3′下游引物：5′-GAACCGATCCGGGATCTCACTC-3′；ID4非甲基化上游引物：5′-GTTTTATCCGGATTTACGGTTTG-3′下游引物：5′-AAATACCGGTCAATCGACCC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為155 bp，MS-PCR反應(yīng)體系包括Master Mix 12.5 μl、上下游引物各2 μl、模板DNA 2 μl，補(bǔ)雙蒸餾水至25 μl。擴(kuò)增反應(yīng)步驟：94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行觀察，PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

完全甲基化：僅有155 bp甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的標(biāo)本判定；完全非甲基化：只有156 bp非MS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的為ID4基因；部分甲基化：表達(dá)以上2種擴(kuò)增產(chǎn)物。ID4基因完全和部分甲基化的患者均定為甲基化。

1.3 預(yù)后隨訪

所有患兒隨訪到2020年7月1日，記錄患兒的總生存時(shí)間與無事件生存時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS for windows version20.00統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述(對(duì)比為t檢驗(yàn)與方差分析等)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)(對(duì)比為卡方檢驗(yàn)與方差分析等)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析與多因素logistic回歸方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ID4甲基化率對(duì)比

慢性期、加速期、急變期患兒的ID4甲基化率分別為3.1%(1/32)、46.4%(13/28)和90.0%(18/20)，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.348，P<0.05)。

2.2 預(yù)后情況對(duì)比

80例患兒總生存時(shí)間平均為(18.29±1.22)個(gè)月，無事件生存時(shí)間平均為(10.48±1.78)個(gè)月，其中慢性期、加速期、急變期患兒的總生存時(shí)間、無事件生存時(shí)間對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病情程度患兒的總生存時(shí)間、無事件生存時(shí)間對(duì)比月)

2.3 相關(guān)性分析

在80例患兒中，Spearman相關(guān)分析顯示ID4甲基化率與病情程度、總生存時(shí)間、無事件生存時(shí)間都存在相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表3 ALL患兒抑癌基因ID4甲基化率與疾病進(jìn)展的相關(guān)性(n=80)

2.4 影響因素分析

在80例患兒中，多因素logistic回歸方法顯示ID4甲基化率、病情程度都為影響患兒總生存時(shí)間、無事件生存時(shí)間的主要影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響ALL患兒預(yù)后的多因素分析(n=80)

3 討論

ALL作為一類高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在臨床上主要表現(xiàn)為骨髓髓系增生、脾臟腫大、外周血白細(xì)胞增多等[10]。ALL的治療原則是緩解患者病情、降低死亡率，主要治療方法為化療與放療；但是由于各種因素的影響，很多患者對(duì)化療與放療都有一定的耐受性，從而導(dǎo)致治療失敗。ALL可分為慢性期、加速期及急變期，慢性期癥狀表現(xiàn)無特異性；而進(jìn)展期常表現(xiàn)為臟器浸潤(rùn)；急變期預(yù)后較差，可危及患者生命，為此加強(qiáng)早期診斷與干預(yù)具有重要的價(jià)值[11]。

現(xiàn)代研究表明ALL的發(fā)生是細(xì)胞遺傳調(diào)控及表觀遺傳調(diào)控的紊亂所引起，其中表觀遺傳可以在不改變遺傳信息的前提下引發(fā)細(xì)胞遺傳性改變[12]?；騿?dòng)子區(qū)DNA甲基化就是重要的表觀遺傳調(diào)控內(nèi)容，其可引起基因表達(dá)沉默，從而下調(diào)抑癌基因表達(dá)，導(dǎo)致ALL的發(fā)生。ID4基因位于46p22-21號(hào)染色體上，既能發(fā)揮抑癌的作用，又能發(fā)揮致癌的作用，可參與細(xì)胞周期調(diào)控過程，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡發(fā)揮作用。ID4基因啟動(dòng)子區(qū)富含CpG島，ID4啟動(dòng)子區(qū)甲基化是ID4基因表達(dá)的主要負(fù)性因子。本研究顯示慢性期、加速期、急變期患兒的ID4甲基化率分別為3.1%、46.4%和90.0%，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明隨著病情的惡化，ALL兒童的ID4甲基化率逐漸升高。當(dāng)前也有研究表明ID4基因啟動(dòng)子區(qū)在正常人骨髓中呈完全非甲基化狀態(tài)，而在ALL患者中則出現(xiàn)高達(dá)80%以上的甲基化[13]。

隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)的快速發(fā)展，早期診斷ALL與預(yù)測(cè)預(yù)后成為可能。有學(xué)者回顧性研究發(fā)現(xiàn)，<6歲的ALL患兒完全緩解率在50%左右，3年生存率不超過20%[14]。ID4蛋白屬于螺旋環(huán)螺旋家族成員之一，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化等作用。ID4基因的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可導(dǎo)致ID4的表達(dá)沉默，并使其抑癌作用消失，從而導(dǎo)致白血病的發(fā)生。也有研究表明惡性腫瘤ID4基因可頻繁發(fā)生甲基化，而沒有發(fā)生突變，提示ID4基因甲基化可導(dǎo)致ID4基因功能喪失，可能是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因[15]。本研究顯示在80例患兒中，總生存時(shí)間為(18.29±1.22)個(gè)月，無事件生存時(shí)間為(10.48±1.78)個(gè)月，慢性期、加速期、急變期患兒的總生存時(shí)間、無事件生存時(shí)間對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明病情程度與患兒的預(yù)后顯著相關(guān)。

ID4又稱為分化抑制因子，其作為HLH家族成員的ID分子，需要與bHLH結(jié)合成異二聚體后，才能抑制bHLH與DNA及其他組織特異性bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而參與細(xì)胞周期調(diào)控過程[16]。ID4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是ID4基因表達(dá)的主要負(fù)性因素，ID4啟動(dòng)子區(qū)甲基化與ID4 mRNA、蛋白表達(dá)缺失密切相關(guān)[17]。本研究Spearman相關(guān)分析顯示ALL患兒的ID4甲基化率與病情程度、總生存時(shí)間、無事件生存時(shí)間都存在相關(guān)性(P<0.05)；多因素logistic回歸方法顯示ID4甲基化率、病情程度都為影響患兒總生存時(shí)間、無事件生存時(shí)間的主要影響因素(P<0.05)。從機(jī)制上分析，當(dāng)ID4基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 甲基化異常升高時(shí)，可造成ID4基因沉默發(fā)生，從而促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致疾病惡化，促進(jìn)患兒死亡[18-19]。本研究也存在一定的不足，表現(xiàn)為病例數(shù)較少且沒有對(duì)ID4基因其他區(qū)域進(jìn)行甲基化分析，這將在后續(xù)研究中加大樣本深入探討。

總之，隨著病情的進(jìn)展，ALL患兒的ID4甲基化率逐漸升高，且與患兒預(yù)后生存時(shí)間相關(guān)，ID4甲基化可作為ALL患兒預(yù)后評(píng)估的新的指標(biāo)。