培養(yǎng)濾液MPT64抗原檢測(cè)陰性結(jié)核分枝桿菌的基因多態(tài)性分析

趙國(guó)連 談小文 崔曉利 黨麗云

目前，一些分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)可以很容易實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)和非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)的鑒別。但這些技術(shù)對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施和操作人員的熟練程度有較高要求[1]。因此，快速、敏感、簡(jiǎn)便的MTB鑒定方法對(duì)結(jié)核病的準(zhǔn)確診斷和正確治療至關(guān)重要。MPT64抗原檢測(cè)的膠體金免疫層析法可用于BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960液體培養(yǎng)”)陽(yáng)性分枝桿菌菌種的快速鑒定，價(jià)格便宜、方便使用、15 min內(nèi)可獲得結(jié)果[2]，在德國(guó)、日本和南非等地的研究中均表現(xiàn)出較高的診斷效能[3]。然而，也有研究顯示，MPT64抗原檢測(cè)在MTB鑒別中存在一定量的假陰性結(jié)果，認(rèn)為可能與MTB的MPT64基因多態(tài)性相關(guān)[4-5]。因此，筆者通過(guò)基因測(cè)序比對(duì)，分析MPT64抗原檢測(cè)假陰性MTB的基因多態(tài)性，以期獲得MPT64抗原檢測(cè)假陰性結(jié)果產(chǎn)生的原因。

資料和方法

一、菌株來(lái)源

收集2018年1月至2020年6月就診于西安市胸科醫(yī)院行痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腹腔積液等標(biāo)本分枝桿菌MGIT 960液體培養(yǎng)的疑似肺結(jié)核患者資料，選取培養(yǎng)陽(yáng)性且經(jīng)分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢確認(rèn)為陽(yáng)性，并有MPT64抗原檢測(cè)(膠體金免疫層析法)、對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生長(zhǎng)試驗(yàn)和分枝桿菌菌種鑒定(DNA微陣列芯片法)結(jié)果的1962例患者分枝桿菌臨床分離株作為研究對(duì)象。對(duì)其中MPT64抗原檢測(cè)與分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果不一致的菌株(本院研究室保存)行GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)和PNB培養(yǎng)檢測(cè)，并對(duì)MPT64抗原檢測(cè)陰性但菌種鑒定結(jié)果為MTB的14株菌株進(jìn)行MPT64基因測(cè)序。

二、研究方法

1.MGIT 960液體培養(yǎng)：收集標(biāo)本行液化去污處理[6]，將0.5 ml處理后標(biāo)本接種于MGIT 960分枝桿菌生長(zhǎng)指示管中，充分混勻，室溫靜置30 min。于37 ℃在MGIT 960系統(tǒng)中孵育，最長(zhǎng)42 d，并定期監(jiān)控。培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢確認(rèn)。

2.MPT64抗原檢測(cè)(膠體金免疫層析法)：將MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性且分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢確認(rèn)陽(yáng)性的標(biāo)本按照MPT64抗原檢測(cè)試劑盒(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。對(duì)MPT64抗原檢測(cè)陰性的菌株，14 d后再次行MPT64抗原檢測(cè)。

3.PNB/TCH培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)：采用微孔板肉湯(PNB)培養(yǎng)基(珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，培養(yǎng)7～10 d后觀察菌株生長(zhǎng)情況，有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)可初步鑒定為NTM。

4.分枝桿菌菌種鑒定：同時(shí)將MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性且經(jīng)分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢確認(rèn)陽(yáng)性的標(biāo)本應(yīng)用DNA微陣列芯片法試劑盒(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。將提取的核酸模板2 μl加入18 μl擴(kuò)增反應(yīng)液，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將6 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物與9 μl雜交緩沖液混合。經(jīng)95 ℃ 5 min變性后與芯片進(jìn)行雜交。在50 ℃恒溫水浴鍋中雜交2 h后進(jìn)行洗滌、掃描。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判讀：當(dāng)探針信號(hào)值大于參考值時(shí)判讀為陽(yáng)性，否則為陰性。將所有探針信號(hào)值排序，獲取最大探針信號(hào)值。若最大信號(hào)值為陰性，則報(bào)告“無(wú)分枝桿菌”；若只有1條探針為陽(yáng)性結(jié)果，則表示待測(cè)樣本為該探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的分枝桿菌菌種或菌群；若1條以上探針為陽(yáng)性結(jié)果，則通過(guò)探針組合情況來(lái)確定待測(cè)樣本所對(duì)應(yīng)的分枝桿菌菌種或菌群。

5. GeneXpert檢測(cè)：對(duì)MPT64抗原檢測(cè)與分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果不一致的菌株行GeneXpert檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。當(dāng)GeneXpert檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，鑒定為MTB。

6.MPT64基因測(cè)序：將MPT64抗原檢測(cè)陰性而菌種鑒定結(jié)果為MTB的菌株及H37Rv對(duì)照菌株(來(lái)源于2019年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的熟練度測(cè)試菌株)及MPT64抗原檢測(cè)陽(yáng)性的MTB臨床分離株各1株)所提取的DNA，依據(jù)之前報(bào)道的MPT64引物(正向：5′-TCGATCTGCTAGCTTGAGTCTGGT-3′；反向：5′-ACCACCGCACCAA GGCTGTCTA-3′)[7]進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃ 45 s變性，62 ℃ 45 s退火，72 ℃ 70 s延伸，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)并送生物工程(上海)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與H37Rv菌株在BioEdit軟件上使用Cluster W多序列比對(duì)，并標(biāo)記發(fā)生突變的核苷酸序列。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用“構(gòu)成比或百分率(%)”表示。以基因芯片檢測(cè)為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)MPT64抗原檢測(cè)MTB的診斷效能，各指標(biāo)計(jì)算公式如下：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%。各方法間的一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75說(shuō)明一致性較好；0.4≤Kappa值<0.75說(shuō)明一致性一般；Kappa值<0.4說(shuō)明一致性較差。

結(jié) 果

一、MPT64抗原檢測(cè)情況

1962株菌株的DNA微陣列芯片法菌種鑒定結(jié)果與培養(yǎng)后細(xì)菌PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果一致，其中88株(4.5%)為NTM，1874株(95.5%)為MTB。88株NTM菌株中，MPT64抗原檢測(cè)陰性菌株87株(98.9%)，1株陽(yáng)性菌株經(jīng)GeneXpert和PNB培養(yǎng)鑒定為MTB與NTM混合感染，但因NTM生長(zhǎng)較快而在培養(yǎng)物中成為優(yōu)勢(shì)菌。1874株MTB菌株中，MPT64抗原檢測(cè)陰性14株(0.7%)，陽(yáng)性1860株(99.3%)。對(duì)于分枝桿菌MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，以DNA微陣列芯片法檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，MPT64抗原檢測(cè)對(duì)MTB的檢測(cè)效能見(jiàn)表1。

表1 MPT64抗原檢測(cè)以DNA微陣列芯片法為參照方法鑒定分枝桿菌菌種的結(jié)果

二、MPT64基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

對(duì)MPT64抗原檢測(cè)陰性的14株MTB臨床分離株(1～14號(hào))和1株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株(15號(hào))及MPT64抗原檢測(cè)陽(yáng)性的1株MTB臨床分離株(16號(hào))的MPT64蛋白基因擴(kuò)增后行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1。與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，3號(hào)標(biāo)本有大約1300 bp的大片段插入，而其他MPT64抗原檢測(cè)陰性標(biāo)本有小片段缺失。16號(hào)MPT64抗原檢測(cè)陽(yáng)性MTB菌株與H37Rv菌株無(wú)肉眼可見(jiàn)差異。

注 M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量Marker 2000 bp；1～14號(hào)泳道為MPT64抗原檢測(cè)陰性的結(jié)核分枝桿菌MPT64基因條帶，15號(hào)泳道為H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株MPT64基因條帶，16號(hào)泳道為MPT64抗原檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)核分枝桿菌臨床分離株MPT64基因條帶

三、MPT64基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)14株MPT64抗原檢測(cè)陰性的MTB臨床分離株、1株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株、1株MPT64抗原檢測(cè)陽(yáng)性的MTB臨床分離株進(jìn)行MPT64基因測(cè)序。結(jié)果顯示，14株MPT64抗原檢測(cè)陰性的MTB臨床分離株發(fā)生MPT64基因第197～259位核苷酸缺失突變，導(dǎo)致第66～86位氨基酸缺失者達(dá)92.9%(13/14)；另1株(3號(hào)泳道)MPT64蛋白基因在第587位點(diǎn)插入了1361 bp的IS6110基因片段。而MPT64抗原檢測(cè)陽(yáng)性的MTB臨床分離株與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株基因一致，未發(fā)生MPT64基因的突變。具體見(jiàn)表2。

討 論

MPT64抗原檢測(cè)是使用小鼠單克隆抗MPT64抗體檢測(cè)MTB菌株MPT64分泌蛋白的方法。MPT64分泌蛋白是由RD2區(qū)域基因編碼的主要濾液蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量24 000)，能夠在培養(yǎng)早中期分泌并釋放于MTB菌體外。故MPT64抗原檢測(cè)的膠體金免疫層析法可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性分枝桿菌菌株的快速鑒定，有效區(qū)分MTB和NTM。既往有學(xué)者采用MTB抗原膠體金法檢測(cè)853株分枝桿菌臨床分離株，以PNB/TCH傳統(tǒng)菌種鑒定方法為參照標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為99.0%、98.9%、99.9%、91.8%[8]。然而，也有研究報(bào)道了MPT64抗原檢測(cè)存在假陰性的結(jié)果[4-5,7,9]，這可能與培養(yǎng)液中細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)量不足有關(guān)，但更多的報(bào)道認(rèn)為與MPT64基因多態(tài)性相關(guān)[5，9]。

本研究顯示，對(duì)于分枝桿菌MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，以DNA微陣列基因芯片法檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，MPT64抗原檢測(cè)MTB的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)99.9%，可認(rèn)為以MPT64抗原檢測(cè)陽(yáng)性為確定分離培養(yǎng)物為MTB的方法具有較高的可靠性。同時(shí)，筆者對(duì)1874株MTB菌株行MPT64抗原檢測(cè)，共檢出14株(0.7%)陰性菌株，低于各地報(bào)道的占比(1.4%～6.8%)[5，10-11]，可能與不同國(guó)家與地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)譜系間的差異有關(guān)[12]。故認(rèn)為當(dāng) MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)MPT64抗原檢測(cè)為陰性時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步采用其他菌種鑒定方法，以避免誤診和漏診。

本研究對(duì)14株MPT64抗原檢測(cè)陰性的MTB行MPT64基因擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)13株(92.9%)發(fā)生了MPT64基因第197～259位點(diǎn)的63 bp核苷酸缺失突變，導(dǎo)致第66～86位氨基酸的缺失，與易松林等[13]對(duì)2017年湖南省85株MPT抗原陰性的臨床分離株進(jìn)行測(cè)序，有81株(95.3%)MPT64基因存在63 bp堿基缺失突變的研究結(jié)論相近。提示MPT64基因突變可能存在地域聚集性，但也可能存在多種單個(gè)位點(diǎn)突變或者單個(gè)堿基插入的情況。Jiang等[14]模擬分析了這些63 bp缺失的MPT64基因蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示突變蛋白存在α螺旋缺陷，相鄰β片段卷曲程度增加，可能是發(fā)生整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化的原因。此外，易松林等[13]研究還發(fā)現(xiàn)MPT64單位點(diǎn)非同義突變也會(huì)導(dǎo)致MPT64抗原檢測(cè)陰性，例如402位G→A突變，613與614位間插入堿基等。Chew等[15]對(duì)2012—2016年分離于新加坡的8株MPT64抗原檢測(cè)陰性的MTB菌株進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，6株存在MPT64基因63 bp堿基缺失突變，1株在第347位點(diǎn)插入2 bp堿基導(dǎo)致移碼突變，1株在第257位點(diǎn)發(fā)生非同義突變。2019年，Singh等[16]對(duì)印度10株MPT64抗原檢測(cè)陰性的MTB菌株進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，4株發(fā)生MPT64基因第26位G缺失突變，4株發(fā)生第37位C缺失突變，說(shuō)明這兩種缺失突變均可導(dǎo)致氨基酸移碼突變，是編碼蛋白多樣性的原因。綜上，不同地區(qū)的MPT64蛋白基因多態(tài)性存在一定差異，但63 bp 堿基缺失突變是我國(guó)境內(nèi)報(bào)道的MPT64抗原檢測(cè)陰性的主要原因。

本研究報(bào)道了中國(guó)第1株因MPT64基因第587位點(diǎn)插入IS6110基因片段而導(dǎo)致MPT64抗原檢測(cè)陰性的MTB菌株，雖與Hillemann等[17]在2005年德國(guó)報(bào)道的1株因MPT64蛋白基因第177位點(diǎn)插入IS6110的多拷貝而導(dǎo)致MPT64蛋白序列中斷的IS6110插入位置不一致，但這兩種位點(diǎn)IS6110插入均導(dǎo)致了MPT64蛋白的變化，可認(rèn)為是MPT64抗原檢測(cè)陰性的原因。

綜上，MPT64抗原檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、時(shí)效性強(qiáng)、敏感度高，可用于培養(yǎng)陽(yáng)性MTB與NTM的快速鑒定。MPT64蛋白基因第197～259位點(diǎn)的63 bp核苷酸缺失突變及IS6110插入突變是本研究MPT64檢測(cè)陰性的主要原因。但由于MPT64抗原檢測(cè)陰性不能完全排除結(jié)核病診斷，仍需使用其他鑒定方法復(fù)核。另外，本研究為單中心研究，獲得的樣本數(shù)量較少，代表性欠佳。此外，對(duì)于MPT64檢測(cè)陽(yáng)性MTB菌株是否存在MPT64基因的同義突變、單位點(diǎn)插入也有待進(jìn)一步研究。