分子標(biāo)記鑒定EMS 誘變高粱突變體的真?zhèn)?/h1>
2021-07-07 12:55:36王春語(yǔ)李政君陳冰嬬張麗霞
遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年3期
王春語(yǔ) 李政君 陳冰嬬 張麗霞
(1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所,遼寧 沈陽(yáng) 110161;2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物海南育種中心,海南樂(lè)東 572541;3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所,吉林 公主嶺 136100)
隨著誘變育種技術(shù)的不斷發(fā)展,誘變育種在高粱中逐漸興起[1]。早在1970 年就利用X-射線、γ-射線、EMS(Ethylmethylsulfone,甲基磺酸乙酯)、MMS(Methyl Methanesulfonate,甲基磺酸甲酯)、DES(Diethyl sulfate,硫酸二乙酯)和NEU(N-Ethyl-N-nitrosourea,N-乙基-N-亞硝基脲) 誘變3 個(gè)栽培高粱品種,對(duì)其誘變率進(jìn)行了比較研究,結(jié)果表明EMS 是最有效的誘變劑[2]。近幾年,EMS 也在高粱誘變育種中得到廣泛應(yīng)用,分別以粒用高粱BTx623、恢復(fù)系晉粱 5 號(hào)和保持系V4B 等為實(shí)驗(yàn)材料,成功獲得了葉色、矮化、葉形、分蘗、穗型、成熟期、早衰等不同的突變體[3,4]。另外,從1 600 個(gè)單株的高粱EMS 誘變?nèi)后w中篩選出768 個(gè)突變體,并利用Tilling 技術(shù)在該突變體庫(kù)中篩選出了編碼咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的2 個(gè)突變體[5]。
EMS 誘變處理隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的增加,高粱種子發(fā)芽率和成苗率逐漸降低,即使正常出苗對(duì)后期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)都會(huì)產(chǎn)生很大的影響,如植株矮化、葉片皺縮、花期延遲和育性降低等[3～4,6,7]。EMS 處理后,M0代植株單穗結(jié)實(shí)率是非常重要的指標(biāo)之一,結(jié)實(shí)率過(guò)高增加篩選壓力且影響誘變效率;結(jié)實(shí)率過(guò)低種子數(shù)量過(guò)少而造成后代篩選鑒定的困擾,限制了突變體的數(shù)量。M0代誘變處理種子由于數(shù)量大通常采用開(kāi)放授粉的方式進(jìn)行加代繁種,容易接受周圍其它高粱材料花粉而雜交出現(xiàn)假突變體的可能,因此,有必要開(kāi)發(fā)一套實(shí)用的分子標(biāo)記鑒定EMS 誘變突變體的真?zhèn)巍?/p>
本研究基于26 份高粱材料的重測(cè)序數(shù)據(jù),開(kāi)發(fā)了大量≥3 bp 重復(fù)的SSR 分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)分子標(biāo)記有效性和豐度檢測(cè),選擇PCR 擴(kuò)增目標(biāo)條帶較單一、多態(tài)性豐富的30 個(gè)標(biāo)記用于EMS誘變突變體真?zhèn)蔚蔫b定。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
5 個(gè)RIL 群體株系分別為:10S008、10S242、9G008、9G015 和4WY006,其中10S008 和10S242均為BTx623 和Rio 雜交構(gòu)建RIL 群體的2 個(gè)株系;9G008 和9G015 均為BTx623 和L316(中國(guó)農(nóng)家種)雜交構(gòu)建RIL 群體的2 個(gè)株系;4WY006 為BTx623 和13-9(高粱微核心種質(zhì))雜交構(gòu)建RIL群體的1 個(gè)株系。5 個(gè)已知突變體(5M192、4A550、A129、A108 和ZY1)均為BTx623 經(jīng)EMS誘變獲得的突變體,5M192 和4A550 為蠟層缺失突變體,A129 和A108 為葉色突變體,ZY1 為葉型突變體,均為實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)定位或者克隆基因的突變體。5 個(gè)新篩選突變株3T133、4A317、2E52、4A478 和4A211 均為2019 年篩選獲得的與親本BTx623 存在表型差異的EMS 誘變株系。
30 份高粱微核心種質(zhì)來(lái)自國(guó)際半干旱研究所,其中包括世界不同地區(qū)的農(nóng)家種和栽培種。
粒用高粱BTx623,遼糯3 由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所提供。
以上實(shí)驗(yàn)材料均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所分子改良實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 SSR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)
為了開(kāi)發(fā)更多有效的高粱SSR 分子標(biāo)記,本課題組對(duì)14 份不育系和12 份恢復(fù)系高粱材料進(jìn)行10×重測(cè)序后開(kāi)發(fā)SSR 分子標(biāo)記[8]。開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)為:2 bp 重復(fù)次數(shù)≥6 次、3 bp 重復(fù)次數(shù)≥5 次、4 bp 重復(fù)次數(shù)≥4 次、5 bp 重復(fù)次數(shù)≥3 次以及6 bp 重復(fù)次數(shù)≥3 次,重測(cè)序、數(shù)據(jù)分析及SSR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)均由北京普朗泰科生物科技有限公司完成。
1.2.2 PCR 擴(kuò)增體系及程序
PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μl,包括2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye) 10 μl,正向引物F 0.3 μl,反向引物R 0.3 μl,DNA 1 μl (≤100 ng)和ddH2O 8.4 μl。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(35 cycles),72 ℃ 10 min。2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye)(貨號(hào):AS111-11)購(gòu)買于北京全式金生物技術(shù)有限公司,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳
玻璃板用酒精擦洗干凈,并用密封膠條、夾子和墊片將玻璃板固定好。將8 ml 30%丙烯酰胺預(yù)制膠(上海迪申生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):B1610156)、4 ml 5×TBE 溶液、27.5 ml 蒸餾水、450 μl 10%過(guò)硫酸銨和50 μl TEMED(四甲基乙二胺)充分混均迅速灌入裝好的玻璃板中,插上梳子,室溫放置15 min 以上,配置成6%聚丙烯酰胺凝膠。將制備好的膠板放置于已經(jīng)加入1×TBE 緩沖液的垂直電泳槽中,每個(gè)PCR 擴(kuò)增樣品上樣1.5 μl,130 V、電泳40 min～1 h 后關(guān)閉電源。取膠,放入硝酸銀染色液(0.5 g AgNO3充分溶于500 ml 蒸餾水)染色15 min,用蒸餾水沖洗染色后的膠3 次,然后放入顯影液(10 g NaOH、0.2 g 碳酸氫鈉充分溶于500 ml 蒸餾水中,再加入5 ml 甲醛混均,現(xiàn)用現(xiàn)配),輕搖至膠顯出清晰的條帶為止。照相,存儲(chǔ),記錄、分析數(shù)據(jù)。
2 結(jié)果與分析
2.1 SSR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)
基于26 份高粱材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)以及SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn),共開(kāi)發(fā)了24 441 個(gè)SSR 標(biāo)記,其中2 bp 重復(fù)共有11 051 個(gè),≥3 bp 重復(fù)的共有13 390 個(gè)(圖1)。
為了便于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)以及分析,選擇≥3 bp 重復(fù)的SSR 多態(tài)標(biāo)記用于本研究。分別選擇100 個(gè)位于基因上和100 個(gè)位于非基因上的SSR 標(biāo)記,以BTx623 和雜交種遼糯3為材料檢測(cè)標(biāo)記的有效性。其中,位于基因上的7 個(gè)標(biāo)記以及位于非基因上的4 個(gè)標(biāo)記在兩份材料中無(wú)擴(kuò)增條帶,判定為無(wú)效標(biāo)記(圖2)。
因此,基因上和非基因上共有189 個(gè)SSR 分子標(biāo)記PCR 可以有效擴(kuò)增目標(biāo)條帶,分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)成功率達(dá)到94.5%。
2.2 SSR 分子標(biāo)記鑒定
為了檢測(cè)SSR 分子標(biāo)記的豐度,隨機(jī)選擇30份高粱微核心種質(zhì)材料檢測(cè)189 個(gè)標(biāo)記在自然群體材料中的多態(tài)性。選擇多態(tài)性≥2 的標(biāo)記作為檢測(cè)備用標(biāo)記,符合此標(biāo)準(zhǔn)的基因上共有19 個(gè)標(biāo)記,非基因上共有51 個(gè)標(biāo)記(圖3)。
為了提高標(biāo)記鑒別能力以及實(shí)用性,從70 個(gè)標(biāo)記中選擇PCR 擴(kuò)增目標(biāo)條帶較單一、多態(tài)性差異大、且便于聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的30 個(gè)標(biāo)記用于EMS 突變體真?zhèn)舞b定。30 個(gè)標(biāo)記每條染色體平均分布3 個(gè),其中3 個(gè)標(biāo)記位于基因上,27個(gè)標(biāo)記位于非基因上(表1)。
以基因上標(biāo)記Chr8-3 為例,該標(biāo)記在30 份自然群體材料中共有3 種多態(tài)類型,分別為I 型、II 型和III 型(圖4);而非基因上標(biāo)記Chr1-12 在30 份自然群體材料中共有8 種多態(tài)類型,分別為I 型、II 型、III 型、IV 型、V 型、VI 型、VII 型和VIII型(圖5)。
2.3 SSR 分子標(biāo)記驗(yàn)證
EMS 誘變后代通常采用開(kāi)放授粉,易接受其它高粱材料花粉后雜交產(chǎn)生假突變體的可能性。選擇5 個(gè)其他高粱材料和BTx623 雜交后獲得的RIL 群體株系以及5 個(gè)BTx623 經(jīng)EMS 誘變后獲得的已知突變體驗(yàn)證30 個(gè)標(biāo)記的有效性及鑒別能力。5 個(gè)不同RIL 群體株系與親本BTx623 相比,PCR 擴(kuò)增目標(biāo)條帶差異很大。10S008、10S242、9G008、9G015、4WY006 與BTx623 相比,30 個(gè)標(biāo)記中存在差異的標(biāo)記分別為10、11、12、10和9 個(gè)(圖6)。而B(niǎo)Tx623 經(jīng)EMS 誘變后5 個(gè)已知突變體 A129、ZY1、A108、5M192、4A550 與BTx623 相比,30 個(gè)標(biāo)記PCR 擴(kuò)增條帶無(wú)差異(圖7)。
由此可見(jiàn),本研究開(kāi)發(fā)、篩選的30 個(gè)標(biāo)記可以用于突變體真?zhèn)蔚蔫b定。
2.4 EMS 誘變突變體鑒定
利用上述30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記鑒定2019 年新篩選到的有明顯表型差異的株系是否為BTx623經(jīng)EMS 誘變后獲得的突變體。
3T133、4A317 和2E52 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,電泳結(jié)果顯示30 個(gè)標(biāo)記目標(biāo)條帶大小與親本一致,為BTx623 經(jīng)EMS 誘變后獲得的突變體(圖7)。4A478 和4A211 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,分別有6 個(gè)和5個(gè)標(biāo)記PCR 擴(kuò)增條帶大小和BTx623 存在差異。經(jīng)過(guò)田間表型調(diào)查,BTx623 葉主脈為蠟脈且無(wú)芒,而4A478 和4A211 為白脈、且存在無(wú)芒、有芒植株分離,因此,判定4A478 和4A211 為假突變體(圖8)。
圖1 SSR 分子標(biāo)記種類及數(shù)量Figure 1 Types and numbers of SSR molecular markers
圖2 基因上和非基因上200 個(gè)SSR 分子標(biāo)記有效性檢測(cè)Figure 2 Effectiveness detection of 200 SSR molecular markers on genes and non-genes
圖4 基因上Chr8-3 標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Figure 4 Polymorphism detection of Chr8-3 marker on gene
圖5 非基因上Chr1-12 標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Figure 5 Polymorphism detection of Chr1-12 marker on non-gene
圖6 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)BTx623 與5 個(gè)RIL 群體株系30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記的差異Figure 6 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 RIL lines detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis
圖7 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)BTx623 與5 個(gè)已知EMS 突變體30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記的差異Figure 7 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 known EMS mutants detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis
圖8 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)BTx623 與5 個(gè)新篩選EMS 突變體30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記的差異Figure 8 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 newly screened EMS mutants detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis
3 結(jié)論與討論
EMS 誘變劑處理濃度和處理時(shí)間對(duì)M0代種子的萌發(fā)率、出苗率、植株長(zhǎng)勢(shì)以及結(jié)實(shí)率都有較大的影響。高粱材料不同,EMS 處理時(shí)間和濃度也不同[3,7]。綜合考慮M0代處理種子的出苗率、結(jié)實(shí)率和突變效率,對(duì)于粒用高粱BTx623 采用0.2% EMS 處理20 h 后,結(jié)實(shí)率為15.3%[3]。隨著EMS 處理濃度和處理時(shí)間的增加,M0代植株的結(jié)實(shí)率顯著較低,其中對(duì)花粉活力的傷害更大,柱頭更容易接受外來(lái)花粉。為了保證誘變后種子的純度,我們嘗試M0代植株全部套袋自交,結(jié)果導(dǎo)致結(jié)實(shí)率更低、甚至不結(jié)實(shí)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。為了保證M0代植株正常結(jié)實(shí)通常種植于隔離區(qū)開(kāi)放授粉,但是由于M0代植株花粉活力受損以及高粱是常異花授粉作物,即使這樣仍然存在和其他高粱材料雜交的可能。當(dāng)篩選到差異表型植株時(shí),有必要鑒定這些植株是來(lái)自雜交還是誘變。
兩個(gè)不同高粱材料雜交,由于染色體大片段交換,即使多代自交成為RIL 群體株系,與親本相比,分子標(biāo)記檢測(cè)后不同株系之間差異很大。如10S008 和10S242 是BTx623 與Rio 雜交獲得的2個(gè)RIL 群體株系,與親本BTx623 相比,30 個(gè)分子標(biāo)記中存在差異的標(biāo)記分別為10 個(gè)和11 個(gè)(圖6)。然而B(niǎo)Tx623 經(jīng)EMS 誘變獲得的突變體則不同,30 個(gè)標(biāo)記在不同突變體中PCR 擴(kuò)增條帶均與親本一致(圖7、圖8)。
選擇PCR 擴(kuò)增條帶單一、多態(tài)性豐富、且不同材料間片段差異大的分子標(biāo)記更利于聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析、統(tǒng)計(jì)。由于基因在不同材料間的保守性,開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記數(shù)量有限?；?6份高粱材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)共開(kāi)發(fā)了24 441 個(gè)≥2 bp 重復(fù)的SSR 分子標(biāo)記,其中位于單拷貝基因(含編碼區(qū)、UTR區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和啟動(dòng)子上下游2 kb)內(nèi)共有6 733 個(gè)[8]。本研究篩選到的30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記,3 個(gè)標(biāo)記位于基因上,27 個(gè)位于非基因上(表1)。位于基因上的標(biāo)記往往多態(tài)性差、鑒別能力低,但是PCR 擴(kuò)增目標(biāo)條帶較為單一利于分析(圖4)。然而位于非基因上的標(biāo)記,PCR 擴(kuò)增非目標(biāo)條帶較多,但是多態(tài)性豐富,鑒別能力強(qiáng)(圖5)。
EMS 誘變通常產(chǎn)生單堿基突變[9,10],但是也會(huì)造成單堿基、多堿基缺失,堿基缺失的概率一般不會(huì)超過(guò)高粱基因組大小的2%(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此,適宜用SSR 分子標(biāo)記的方法鑒定EMS 誘變突變體的真?zhèn)巍＠?0 個(gè)標(biāo)記檢測(cè),如果是雜交后產(chǎn)生的假突變體,與親本存在差異的標(biāo)記數(shù)目通常較多(圖6)。倘若與親本相比,只有1 個(gè)標(biāo)記存在差異,該突變體的真假還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
本研究基于26 份高粱材料的重測(cè)序數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)對(duì)分子標(biāo)記有效性以及多態(tài)性鑒定,篩選到≥3 bp 重復(fù)的30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記用于EMS 突變體真?zhèn)舞b定。
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1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
5 個(gè)RIL 群體株系分別為:10S008、10S242、9G008、9G015 和4WY006,其中10S008 和10S242均為BTx623 和Rio 雜交構(gòu)建RIL 群體的2 個(gè)株系;9G008 和9G015 均為BTx623 和L316(中國(guó)農(nóng)家種)雜交構(gòu)建RIL 群體的2 個(gè)株系;4WY006 為BTx623 和13-9(高粱微核心種質(zhì))雜交構(gòu)建RIL群體的1 個(gè)株系。5 個(gè)已知突變體(5M192、4A550、A129、A108 和ZY1)均為BTx623 經(jīng)EMS誘變獲得的突變體,5M192 和4A550 為蠟層缺失突變體,A129 和A108 為葉色突變體,ZY1 為葉型突變體,均為實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)定位或者克隆基因的突變體。5 個(gè)新篩選突變株3T133、4A317、2E52、4A478 和4A211 均為2019 年篩選獲得的與親本BTx623 存在表型差異的EMS 誘變株系。
30 份高粱微核心種質(zhì)來(lái)自國(guó)際半干旱研究所,其中包括世界不同地區(qū)的農(nóng)家種和栽培種。
粒用高粱BTx623,遼糯3 由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所提供。
以上實(shí)驗(yàn)材料均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所分子改良實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 SSR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)
為了開(kāi)發(fā)更多有效的高粱SSR 分子標(biāo)記,本課題組對(duì)14 份不育系和12 份恢復(fù)系高粱材料進(jìn)行10×重測(cè)序后開(kāi)發(fā)SSR 分子標(biāo)記[8]。開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)為:2 bp 重復(fù)次數(shù)≥6 次、3 bp 重復(fù)次數(shù)≥5 次、4 bp 重復(fù)次數(shù)≥4 次、5 bp 重復(fù)次數(shù)≥3 次以及6 bp 重復(fù)次數(shù)≥3 次,重測(cè)序、數(shù)據(jù)分析及SSR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)均由北京普朗泰科生物科技有限公司完成。
1.2.2 PCR 擴(kuò)增體系及程序
PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μl,包括2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye) 10 μl,正向引物F 0.3 μl,反向引物R 0.3 μl,DNA 1 μl (≤100 ng)和ddH2O 8.4 μl。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(35 cycles),72 ℃ 10 min。2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye)(貨號(hào):AS111-11)購(gòu)買于北京全式金生物技術(shù)有限公司,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳
玻璃板用酒精擦洗干凈,并用密封膠條、夾子和墊片將玻璃板固定好。將8 ml 30%丙烯酰胺預(yù)制膠(上海迪申生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):B1610156)、4 ml 5×TBE 溶液、27.5 ml 蒸餾水、450 μl 10%過(guò)硫酸銨和50 μl TEMED(四甲基乙二胺)充分混均迅速灌入裝好的玻璃板中,插上梳子,室溫放置15 min 以上,配置成6%聚丙烯酰胺凝膠。將制備好的膠板放置于已經(jīng)加入1×TBE 緩沖液的垂直電泳槽中,每個(gè)PCR 擴(kuò)增樣品上樣1.5 μl,130 V、電泳40 min～1 h 后關(guān)閉電源。取膠,放入硝酸銀染色液(0.5 g AgNO3充分溶于500 ml 蒸餾水)染色15 min,用蒸餾水沖洗染色后的膠3 次,然后放入顯影液(10 g NaOH、0.2 g 碳酸氫鈉充分溶于500 ml 蒸餾水中,再加入5 ml 甲醛混均,現(xiàn)用現(xiàn)配),輕搖至膠顯出清晰的條帶為止。照相,存儲(chǔ),記錄、分析數(shù)據(jù)。
2 結(jié)果與分析
2.1 SSR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)
基于26 份高粱材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)以及SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn),共開(kāi)發(fā)了24 441 個(gè)SSR 標(biāo)記,其中2 bp 重復(fù)共有11 051 個(gè),≥3 bp 重復(fù)的共有13 390 個(gè)(圖1)。
為了便于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)以及分析,選擇≥3 bp 重復(fù)的SSR 多態(tài)標(biāo)記用于本研究。分別選擇100 個(gè)位于基因上和100 個(gè)位于非基因上的SSR 標(biāo)記,以BTx623 和雜交種遼糯3為材料檢測(cè)標(biāo)記的有效性。其中,位于基因上的7 個(gè)標(biāo)記以及位于非基因上的4 個(gè)標(biāo)記在兩份材料中無(wú)擴(kuò)增條帶,判定為無(wú)效標(biāo)記(圖2)。
因此,基因上和非基因上共有189 個(gè)SSR 分子標(biāo)記PCR 可以有效擴(kuò)增目標(biāo)條帶,分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)成功率達(dá)到94.5%。
2.2 SSR 分子標(biāo)記鑒定
為了檢測(cè)SSR 分子標(biāo)記的豐度,隨機(jī)選擇30份高粱微核心種質(zhì)材料檢測(cè)189 個(gè)標(biāo)記在自然群體材料中的多態(tài)性。選擇多態(tài)性≥2 的標(biāo)記作為檢測(cè)備用標(biāo)記,符合此標(biāo)準(zhǔn)的基因上共有19 個(gè)標(biāo)記,非基因上共有51 個(gè)標(biāo)記(圖3)。
為了提高標(biāo)記鑒別能力以及實(shí)用性,從70 個(gè)標(biāo)記中選擇PCR 擴(kuò)增目標(biāo)條帶較單一、多態(tài)性差異大、且便于聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的30 個(gè)標(biāo)記用于EMS 突變體真?zhèn)舞b定。30 個(gè)標(biāo)記每條染色體平均分布3 個(gè),其中3 個(gè)標(biāo)記位于基因上,27個(gè)標(biāo)記位于非基因上(表1)。
以基因上標(biāo)記Chr8-3 為例,該標(biāo)記在30 份自然群體材料中共有3 種多態(tài)類型,分別為I 型、II 型和III 型(圖4);而非基因上標(biāo)記Chr1-12 在30 份自然群體材料中共有8 種多態(tài)類型,分別為I 型、II 型、III 型、IV 型、V 型、VI 型、VII 型和VIII型(圖5)。
2.3 SSR 分子標(biāo)記驗(yàn)證
EMS 誘變后代通常采用開(kāi)放授粉,易接受其它高粱材料花粉后雜交產(chǎn)生假突變體的可能性。選擇5 個(gè)其他高粱材料和BTx623 雜交后獲得的RIL 群體株系以及5 個(gè)BTx623 經(jīng)EMS 誘變后獲得的已知突變體驗(yàn)證30 個(gè)標(biāo)記的有效性及鑒別能力。5 個(gè)不同RIL 群體株系與親本BTx623 相比,PCR 擴(kuò)增目標(biāo)條帶差異很大。10S008、10S242、9G008、9G015、4WY006 與BTx623 相比,30 個(gè)標(biāo)記中存在差異的標(biāo)記分別為10、11、12、10和9 個(gè)(圖6)。而B(niǎo)Tx623 經(jīng)EMS 誘變后5 個(gè)已知突變體 A129、ZY1、A108、5M192、4A550 與BTx623 相比,30 個(gè)標(biāo)記PCR 擴(kuò)增條帶無(wú)差異(圖7)。
由此可見(jiàn),本研究開(kāi)發(fā)、篩選的30 個(gè)標(biāo)記可以用于突變體真?zhèn)蔚蔫b定。
2.4 EMS 誘變突變體鑒定
利用上述30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記鑒定2019 年新篩選到的有明顯表型差異的株系是否為BTx623經(jīng)EMS 誘變后獲得的突變體。
3T133、4A317 和2E52 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,電泳結(jié)果顯示30 個(gè)標(biāo)記目標(biāo)條帶大小與親本一致,為BTx623 經(jīng)EMS 誘變后獲得的突變體(圖7)。4A478 和4A211 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,分別有6 個(gè)和5個(gè)標(biāo)記PCR 擴(kuò)增條帶大小和BTx623 存在差異。經(jīng)過(guò)田間表型調(diào)查,BTx623 葉主脈為蠟脈且無(wú)芒,而4A478 和4A211 為白脈、且存在無(wú)芒、有芒植株分離,因此,判定4A478 和4A211 為假突變體(圖8)。
圖1 SSR 分子標(biāo)記種類及數(shù)量Figure 1 Types and numbers of SSR molecular markers
圖2 基因上和非基因上200 個(gè)SSR 分子標(biāo)記有效性檢測(cè)Figure 2 Effectiveness detection of 200 SSR molecular markers on genes and non-genes
圖4 基因上Chr8-3 標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Figure 4 Polymorphism detection of Chr8-3 marker on gene
圖5 非基因上Chr1-12 標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Figure 5 Polymorphism detection of Chr1-12 marker on non-gene
圖6 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)BTx623 與5 個(gè)RIL 群體株系30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記的差異Figure 6 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 RIL lines detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis
圖7 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)BTx623 與5 個(gè)已知EMS 突變體30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記的差異Figure 7 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 known EMS mutants detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis
圖8 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)BTx623 與5 個(gè)新篩選EMS 突變體30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記的差異Figure 8 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 newly screened EMS mutants detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis
3 結(jié)論與討論
EMS 誘變劑處理濃度和處理時(shí)間對(duì)M0代種子的萌發(fā)率、出苗率、植株長(zhǎng)勢(shì)以及結(jié)實(shí)率都有較大的影響。高粱材料不同,EMS 處理時(shí)間和濃度也不同[3,7]。綜合考慮M0代處理種子的出苗率、結(jié)實(shí)率和突變效率,對(duì)于粒用高粱BTx623 采用0.2% EMS 處理20 h 后,結(jié)實(shí)率為15.3%[3]。隨著EMS 處理濃度和處理時(shí)間的增加,M0代植株的結(jié)實(shí)率顯著較低,其中對(duì)花粉活力的傷害更大,柱頭更容易接受外來(lái)花粉。為了保證誘變后種子的純度,我們嘗試M0代植株全部套袋自交,結(jié)果導(dǎo)致結(jié)實(shí)率更低、甚至不結(jié)實(shí)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。為了保證M0代植株正常結(jié)實(shí)通常種植于隔離區(qū)開(kāi)放授粉,但是由于M0代植株花粉活力受損以及高粱是常異花授粉作物,即使這樣仍然存在和其他高粱材料雜交的可能。當(dāng)篩選到差異表型植株時(shí),有必要鑒定這些植株是來(lái)自雜交還是誘變。
兩個(gè)不同高粱材料雜交,由于染色體大片段交換,即使多代自交成為RIL 群體株系,與親本相比,分子標(biāo)記檢測(cè)后不同株系之間差異很大。如10S008 和10S242 是BTx623 與Rio 雜交獲得的2個(gè)RIL 群體株系,與親本BTx623 相比,30 個(gè)分子標(biāo)記中存在差異的標(biāo)記分別為10 個(gè)和11 個(gè)(圖6)。然而B(niǎo)Tx623 經(jīng)EMS 誘變獲得的突變體則不同,30 個(gè)標(biāo)記在不同突變體中PCR 擴(kuò)增條帶均與親本一致(圖7、圖8)。
選擇PCR 擴(kuò)增條帶單一、多態(tài)性豐富、且不同材料間片段差異大的分子標(biāo)記更利于聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析、統(tǒng)計(jì)。由于基因在不同材料間的保守性,開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記數(shù)量有限?；?6份高粱材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)共開(kāi)發(fā)了24 441 個(gè)≥2 bp 重復(fù)的SSR 分子標(biāo)記,其中位于單拷貝基因(含編碼區(qū)、UTR區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和啟動(dòng)子上下游2 kb)內(nèi)共有6 733 個(gè)[8]。本研究篩選到的30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記,3 個(gè)標(biāo)記位于基因上,27 個(gè)位于非基因上(表1)。位于基因上的標(biāo)記往往多態(tài)性差、鑒別能力低,但是PCR 擴(kuò)增目標(biāo)條帶較為單一利于分析(圖4)。然而位于非基因上的標(biāo)記,PCR 擴(kuò)增非目標(biāo)條帶較多,但是多態(tài)性豐富,鑒別能力強(qiáng)(圖5)。
EMS 誘變通常產(chǎn)生單堿基突變[9,10],但是也會(huì)造成單堿基、多堿基缺失,堿基缺失的概率一般不會(huì)超過(guò)高粱基因組大小的2%(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此,適宜用SSR 分子標(biāo)記的方法鑒定EMS 誘變突變體的真?zhèn)巍＠?0 個(gè)標(biāo)記檢測(cè),如果是雜交后產(chǎn)生的假突變體,與親本存在差異的標(biāo)記數(shù)目通常較多(圖6)。倘若與親本相比,只有1 個(gè)標(biāo)記存在差異,該突變體的真假還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
本研究基于26 份高粱材料的重測(cè)序數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)對(duì)分子標(biāo)記有效性以及多態(tài)性鑒定,篩選到≥3 bp 重復(fù)的30 個(gè)SSR 分子標(biāo)記用于EMS 突變體真?zhèn)舞b定。
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