亞麻籽膠-紫花苜蓿葉蛋白改性物的制備及乳化性能研究

高 紅，張 煒，辛小麗，王志娟，甘文梅，乜世成，宋 林

青海師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,西寧 810008

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種優(yōu)質(zhì)豆科類牧草，由于其營養(yǎng)成分豐富、品質(zhì)優(yōu)良、蛋白含量高等特點(diǎn)而被國內(nèi)外研究學(xué)者所青睞[1]。紫花苜蓿產(chǎn)量高、市場價格低，是一種優(yōu)質(zhì)的天然資源。此外紫花苜蓿葉中的粗葉蛋白含量可達(dá)70%左右，且氨基酸種類豐富，其中含有人體必需氨基酸含量達(dá)40.6%[2,3]。由于其自身的功能特性優(yōu)于動物蛋白，所以常做為動物的輔助飼料。然而紫花苜蓿葉蛋白(alfalfa leaf protein concentrates，ALPCs)功能性質(zhì)存在局限性，乳化活性不顯著，在應(yīng)用時往往需要添加具有高乳化活性的糖類物質(zhì)，來提高其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的利用價值。對ALPCs進(jìn)行糖基化改性，提高其乳化性能具有潛在的利用價值。目前，常用的蛋白乳化改性方法有化學(xué)改性法、物理改性法和酶改性法等。其中化學(xué)改性法中的糖基化改性法是一種溫和綠色的蛋白質(zhì)改性方法。通過控制時間、溫度、pH及加熱蛋白質(zhì)與糖類接枝反應(yīng)程度，以期實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的改性。已有研究表明糖基化改性可改善蛋白質(zhì)的乳化性，乳化穩(wěn)定性及抗氧化能力等。目前對ALPCs的研究只停留在產(chǎn)物制備及抗氧化活性的研究[4]，對其乳化性及乳化穩(wěn)定性的研究尚未報(bào)道。因此，為了彌補(bǔ)ALPCs乳化性方面的不足，本研究采用糖基化改性法優(yōu)化制備復(fù)合物，對其復(fù)合物的乳化性能進(jìn)行研究。

研究報(bào)道多糖可以改善蛋白質(zhì)的乳化性能，亞麻籽膠(flaxseed gum，F(xiàn)G)，又稱為富蘭克膠，是由酸性多糖和中性多糖組成的一種天然新型親水膠體[5]。研究表明親水膠體由于其含有一定量的結(jié)合蛋白，使得FG本身持有良好的乳化性，增稠性及起泡性。此外，F(xiàn)G是國家綠色食品發(fā)展中心認(rèn)定的綠色健康安全的食品專用添加劑[6,7]。將FG與ALPCs糖基化結(jié)合，在改善蛋白質(zhì)性能方面表現(xiàn)出來巨大的潛力，已成為食品領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。

目前常用的糖基化改性方法主要有干法改性法和濕法改性法[8]，干法反應(yīng)溫度受限，一般為60～65 ℃，而濕法反應(yīng)溫度較廣泛，一般包括低溫反應(yīng)(60～62 ℃)和高溫反應(yīng)(100～120 ℃)。由于濕熱反應(yīng)具有反應(yīng)周期短，與底物接觸充分等的優(yōu)勢，故本實(shí)驗(yàn)在濕熱高溫條件下進(jìn)行改性,利用響應(yīng)面優(yōu)化制備復(fù)合物，采用FG對ALPCs進(jìn)行糖基化修飾研究,通過ALPCs-FG的乳化性能測定及對ALPCs-FG的官能基團(tuán)變化和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，為ALPCs資源的開發(fā)和ALPCs-FG的乳化性能研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紫花苜蓿(采集于青海大學(xué)試驗(yàn)田)；亞麻籽膠(北京索萊寶科技有限公司，分析純)；鄰苯二甲醛(購于上海麥克林生化科技有限公司)；鹽酸、氫氧化鈉(購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；所有試劑均為分析純，除非另有說明。

1.2 儀器與設(shè)備

101A-1E電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海儀器實(shí)驗(yàn)廠有限公司)；磁力攪拌器(廣州儀器設(shè)備有限公司)；PB-10pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；高壓滅菌器(上海審安醫(yī)療器械廠)；IKA分散均質(zhì)機(jī)(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；DelsaMax PRO型激光粒度分析儀；X—射線粉末衍射儀(日本島津公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(美國賽默飛公司)；掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司)；高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限責(zé)任公司)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫花苜蓿葉蛋白(ALPCs)的提取

參考Liu等[9]的提取方法，略微改動。將提取的ALPCs在其等電點(diǎn)(pH=4.0)下，70 ℃條件下絮凝10 min。用無水乙醇洗去ALPCs中的色素，直至洗出液接近無色，冷凍干燥得ALPCs。

1.3.2 單因素條件下紫花苜蓿葉蛋白-亞麻籽膠(ALPCs-FG)的制備

1.3.2.1 不同pH值下ALPCs-FG的制備

按照1∶1的底物比(m(ALPCs)∶m(FG))準(zhǔn)確稱取五份0.2 g的ALPCs于五個錐形瓶中，并分別加入0.1 g的FG，隨后加入100 mL蒸餾水將其配成溶液，超聲10 min使其溶解。用0.1 mol/L的鹽酸、氫氧化鈉溶液調(diào)配五份溶液，其pH調(diào)為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。將調(diào)好pH值的五份溶液放入高壓滅菌器中反應(yīng)，設(shè)定反應(yīng)溫度為90 ℃、反應(yīng)時間為2 h，反應(yīng)結(jié)束后立即用冷水停止其反應(yīng)。隨后溶液用離心機(jī)離心5 min，其轉(zhuǎn)速為8 000 rpm，上清液保留并除去未反應(yīng)的雜質(zhì)，得到ALPCs-FG，對ALPCs-FG的功能性質(zhì)進(jìn)行測定(乳化性及其乳化穩(wěn)定性)。單因素試驗(yàn)均做三次。

1.3.2.2 不同配比下ALPCs-FG的制備

按照1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶3的底物(m(ALPCs)∶m(FG))配比準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為0.1、0.2、0.3、0.1、0.1 g的ALPCs于五個錐形瓶中，并依次加入質(zhì)量為0.1、0.1、0.1、0.2、0.3 g的FG，隨后加入100 mL蒸餾水將其配成溶液，超聲10 min使其溶解。用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)五份溶液的pH值都為8.0。將調(diào)好pH值的五份溶液放入高壓滅菌器中反應(yīng)，設(shè)定反應(yīng)溫度為90 ℃，時間為2 h，反應(yīng)結(jié)束后立即用冷水中止其反應(yīng)。隨后溶液用離心機(jī)離心5 min，其轉(zhuǎn)速為8 000 rpm，上清液保留并除去未反應(yīng)的雜質(zhì)，得到ALPCs-FG，對ALPCs-FG的功能性質(zhì)進(jìn)行測定(乳化性及其乳化穩(wěn)定性)。單因素試驗(yàn)均做三次。

1.3.2.3 不同時間下ALPCs-FG的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g ALPCs于五個錐形瓶中并加入0.1 g的FG，隨后加入100 mL蒸餾水將其配成溶液，超聲10 min使其溶解。用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)五份溶液的pH值都為8.0。將調(diào)好pH值的五份溶液放入高壓滅菌器中反應(yīng)，反應(yīng)溫度設(shè)為90 ℃，反應(yīng)時間分別設(shè)為30、60、90、120、150 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用冷水中止反應(yīng)。隨后溶液用離心機(jī)離心5 min，其轉(zhuǎn)速為8 000 rpm，上清液保留并除去未反應(yīng)的雜質(zhì)，得到ALPCs-FG，對ALPCs-FG的功能性質(zhì)進(jìn)行測定(乳化性及其乳化穩(wěn)定性)。單因素試驗(yàn)均做三次。

1.3.2.4 不同溫度下ALPCs-FG的制備

準(zhǔn)確稱取五份0.1 g ALPCs于五個錐形瓶中并分別加入0.1 g的FG，隨后加入100 mL蒸餾水將其配成溶液，超聲10 min使其溶解。用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)五份溶液的pH值都為8.0。將調(diào)好pH值的五份溶液放入高壓滅菌器中反應(yīng)，反應(yīng)時間設(shè)為2 h，反應(yīng)溫度分別設(shè)為30、50、70、90、110 ℃，反應(yīng)結(jié)束后立即用冷水中止反應(yīng)。隨后溶液用離心機(jī)離心5 min，其轉(zhuǎn)速為8 000 rpm，上清液保留并除去未反應(yīng)的雜質(zhì)，得到ALPCs-FG，對ALPCs-FG的功能性質(zhì)進(jìn)行測定(乳化性及其乳化穩(wěn)定性)。單因素試驗(yàn)均做三次。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ALPCs-FG的乳化性作為響應(yīng)值，采用BOX-Behnken試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，各因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

1.3.4 乳化性的測定方法

根據(jù)Turgeon等[10]的研究方法，略有修改。利用濁度法進(jìn)行測定，選取波長在500 nm處對ALPCs-FG的乳化性(EAI)及其乳化穩(wěn)定性(ESI)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

(2)

其中：DF-稀釋倍數(shù)，100；φ-比色皿光程；C-蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；θ-乳液中油相所占比，25%；A0-0 min時的吸光度；A10-10 min時的吸光度；t-10 min

1.3.5 接枝度測定

參考Church等[11]的方法，稍作修改，采用OPA法測定接枝度。80 μL 1 mg/mL的樣品溶液中加入4 mL鄰苯二甲醛試劑，混合均勻，35 ℃水浴2 min，OPA試劑為空白對照。在340 nm下測吸光值。

(3)

其中：A0：ALPCs的吸光值；A1：ALPCs-FG的吸光值。

1.3.6 傅里葉紅外光譜測定

參考Wu等[12]的方法，采用KBr壓片法。分別取適量冷凍干燥后的ALPCs和ALPCs-FG與一定量溴化鉀混合，研磨成粉末后壓片，設(shè)置分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)32次，隨后用Nicolet iS50FT-IR型傅里葉變換紅外光譜儀作全波段(4 000～400 cm-1)掃描。

1.3.7 粒徑分布測定

參考Hu[18]的方法，略有改動。配置質(zhì)量濃度為1.0%(W/V)蛋白溶液(ALPCs和ALPCs-FG)，將蛋白溶液溶于0.01 moL/L(pH=7.0)磷酸鹽溶液中。添加微量0.02 %NaN3，其目的防止微生物污染。室溫磁力攪拌2 h，4 ℃過夜，使蛋白充分水合。次日離心10 min，取上清液，加入大豆油(油相比φ=25%)，在轉(zhuǎn)速為5 000 rpm下高速均質(zhì)乳化5 min，得測樣乳液，將乳液置于DelsaMax PRO型激光粒度分析儀比色皿中測定其粒徑大小。

1.3.8 X-射線衍射分析

采用X-射線粉末衍射儀(日本島津公司)銅靶Kɑ射線(40 kv，30 mV)，將膜樣品用橡皮泥固定在檢測器上，記錄樣品在2θ=100到2θ=800之間的X-射線衍射(XRD)強(qiáng)度并用jade 6.0分析軟件分析樣品晶體結(jié)構(gòu)變化。

1.3.9 掃描電鏡分析

用導(dǎo)電雙面膠將樣品固定在檢測臺上，將樣品(ALPCs和ALPCs-FG)撒在雙面膠上，吹去多余的粉末，真空下噴金后置于KYKY-EM3200型掃描電子顯微鏡對樣品進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對紫花苜蓿葉蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響

2.1.1 pH值對改性后紫花苜蓿葉蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響

由圖1可知ALPCs在pH值為4.0時有最低的乳化性，而乳化穩(wěn)定性在pH值為4.0時最高，這主要是因?yàn)锳LPCs的等電點(diǎn)在3.2～4.4之間。當(dāng)pH值為4.0時，ALPCs在蒸餾水中幾乎沒有溶解性，這也間接表明ALPCs與FG之間沒有發(fā)生糖基化反應(yīng)。改性的ALPCs的乳化性在pH值為4.0時呈現(xiàn)最低值，而此時的乳化穩(wěn)定性最好。由于本文是以乳化性為響應(yīng)值，從圖中可以看出ALPCs在堿性溶液中具有較好的乳化性，在pH為8.0時具有較高的乳化性，因此，選定pH 8.0作為最佳條件。

圖1 反應(yīng)pH對乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響Fig.1 The effect of reaction pH on emulsification and emulsification stability

2.1.2 底物配比對改性后紫花苜蓿葉蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，當(dāng)ALPCs與FG的質(zhì)量比從3∶1變化到1∶3時，ALPCs的乳化性、乳化穩(wěn)定性的變化與ALPCs和FG之間的配比變化非常顯著，這主要是因?yàn)镕G本身具有較強(qiáng)的乳化性，將其接枝到ALPCs中致使ALPCs乳化能力增強(qiáng)，F(xiàn)G在產(chǎn)物的乳化能力中起主導(dǎo)作用，但當(dāng)FG含量持續(xù)增加后反而使美拉德產(chǎn)物中具有乳化能力的位點(diǎn)減少，導(dǎo)致其乳化能力降低、乳化穩(wěn)定性下降。因此，確定ALPCs與FG質(zhì)量比1∶1為最佳比例。

圖2 底物配比對乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of substrate ratio on emulsification and emulsification stability

2.1.3 時間對改性后紫花苜蓿葉蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，改性的ALPCs的乳化性隨反應(yīng)時間的變化呈現(xiàn)先慢慢增加后急劇下降的趨勢，乳化性在120 min時達(dá)到最大值，而乳化穩(wěn)定性隨反應(yīng)時間變化不明顯，表明乳化穩(wěn)定性跟反應(yīng)時間相關(guān)性差。乳化性變化明顯是因?yàn)殡S著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)更加充分，使ALPCs中被引入更多亞麻籽膠的親水基團(tuán)，反應(yīng)時間在150 min時乳化性最小，可能是因?yàn)锳LPCs-FG體系中油-水分界面間的平衡被破壞，從而降低ALPCs乳液的乳化性。因此，選擇反應(yīng)時間為120 min時為最佳反應(yīng)時間。

圖3 反應(yīng)時間對乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of reaction time on emulsification and emulsification stability

2.1.4 溫度對改性后紫花苜蓿葉蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響

從圖4中可知，反應(yīng)體系溫度在30～90 ℃之間，ALPCs-FG的乳化性隨著反應(yīng)溫度的上升而逐漸變大。在這個溫度范圍內(nèi)，乳化穩(wěn)定性在68 ℃左右時達(dá)到最大值。這主要是因?yàn)榉磻?yīng)速率跟體系的溫度有關(guān)，在適宜的溫度下可促使ALPCs結(jié)構(gòu)伸展，使ALPCs中更多的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致大量親水基團(tuán)、疏水基團(tuán)分別與水層、油層相結(jié)合。而反應(yīng)溫度在90 ℃時具有良好的乳化性，溫度在110 ℃左右時乳化性降低，可能是由于溫度升高導(dǎo)致ALPCs質(zhì)發(fā)生聚集。因此，選擇90 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖4 反應(yīng)溫度對乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of reaction temperature on emulsification and emulsification stability

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差檢驗(yàn)分析

通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出回歸方程：

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表2(Continued Tab.2)

R=203.73-21.94A+9.052B+9.56C-1.53D-13.51AB-16.95AC-6.22AD-5.57BC+1.36BD-7.94CD-52.682-21.64B2-51.54C2-27.092

(4)

表3 改性后紫花苜蓿葉蛋白乳化性線性回歸分析表

2.3 響應(yīng)面3D分析圖及最佳條件確定

根據(jù)回歸方程得出不同因素交互作用的響應(yīng)面3D圖，如下圖5所示。

圖5 兩因素相互作用對改性后ALPCs乳化性影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effect of the interaction of two factors on the emulsification of ALPCs after modification

根據(jù)擬合模型得出：當(dāng)反應(yīng)pH值為8.47，反應(yīng)時間為123.63 min，反應(yīng)溫度為89.62 ℃，底物配比為1∶1.07時，ALPCs的乳化性達(dá)206.94 m2/g，為了驗(yàn)證模型的可靠性，從實(shí)際情況出發(fā)，對最佳條件進(jìn)行調(diào)整：選取反應(yīng)pH值為8.0，反應(yīng)溫度為90 ℃，反應(yīng)時間為124 min，底物配比[m(ALPCs)∶m(FG)]為1∶1作為最佳反應(yīng)條件，最優(yōu)條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到改性后ALPCs乳化性為200.78 m2/g，與理論預(yù)測值的相對誤差為3%，表明結(jié)果可行，該模型結(jié)果與模擬結(jié)果基本一致。在此條件下的接枝度達(dá)23.9%，優(yōu)化后的ALPCs乳化性比未改性的ALPCs乳化性提高了12.20%，乳化穩(wěn)定性提高至31.06 min，比未改性蛋白提高了31.83%。

2.4 傅里葉紅外光譜分析

ALPCs和FG價接后，蛋白質(zhì)分子中羥基含量增加，3 500～3 200 cm-1是-OH 的特征官能團(tuán)吸收峰，3 200～2 800 cm-1是C-H的特征伸縮振動吸收峰。蛋白質(zhì)的特征官能團(tuán)吸收峰是：酰胺Ⅰ帶-NH的特征吸收峰，其位置在1 690～1 630 cm-1之間；酰胺Ⅱ帶-NH的彎曲振動吸收峰，其位置在1 530～1 560 cm-1之間；酰胺Ⅲ帶 分別是C-N和N-H的彎曲振動吸收，其特征峰在1 240～1 450 cm-1之間。從紅外圖(圖6)中可以看出FG在3 390～3 429 cm-1處具有較寬的吸收峰，在2 930 cm-1處有C-H伸縮振動峰。圖中兩個峰比較得出：酰胺Ⅰ帶處的特征峰從1 643 cm-1移至1 653 cm-1；酰胺Ⅱ帶處的特征吸收峰從1 521cm-1處移至1 514 cm-1；酰胺Ⅲ帶的特征吸收峰從1 238 cm-1移至1 236 cm-1。由于發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象導(dǎo)致吸收峰變小，改性后的ALPCs-FG在1 027 cm-1處有強(qiáng)的吸收峰，該吸收峰是糖分子中C-O-C官能團(tuán)的伸縮振動同時也是糖環(huán)存在的特征吸收峰。說明糖基化反應(yīng)可以提高復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性[14]。

圖6 ALPCs及ALPCs-FG紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of ALPCs and ALPCs-FG

2.5 粒徑分析

粒徑的變化與ALPCs聚集程度及與FG反應(yīng)的糖基化程度有關(guān)。兩種物質(zhì)的粒徑分布如下，從圖7中可以看出ALPCs-FG粒徑比ALPCs的粒徑大。本研究中ALPCs的粒徑為603 nm，而ALPCs-FG的粒徑為771 nm。表明糖基化反應(yīng)顯著增大了ALPCs-FG的粒徑，該現(xiàn)象與Wang等[15]、Mou等[16]、Hu等[17]研究結(jié)果一致。主要原因可能是高溫糖基化反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生熱聚變[18]，致使ALPCs-FG粒徑增大。此現(xiàn)象與Rao等[19]的研究現(xiàn)象不一致，可能是由于蛋白成分不同，且乳液體系成分多而復(fù)雜。體系之間發(fā)生的反應(yīng)都將影響粒徑的變化，具體影響機(jī)理有待進(jìn)一步研究討論。但就本文而言，ALPCs-FG的乳液微粒顯著大于ALPCs，F(xiàn)G和ALPCs發(fā)生糖基化反應(yīng)形成了共價鍵，糖基化反應(yīng)通過對ALPCs的包覆提高了乳液的穩(wěn)定性[17]。由于嫁接的親水性多糖能夠在蛋白質(zhì)表面迅速吸附，形成水-油膜層厚度增大[20]，對維持整個體系的乳化穩(wěn)定性也有作用。此外，ALPCs-FG共價復(fù)合物的空間位阻效應(yīng)會對乳液中液滴的聚集和大液滴的形成起到抑制作用，從而進(jìn)一步提高其有乳液的乳化性和穩(wěn)定性[21]，可見糖基化反應(yīng)對修飾后的共價復(fù)合物乳化性及乳化穩(wěn)定性有所提高。

圖7 ALPCs及ALPCs-FG粒徑分布圖Fig.7 Diameter distribution of ALPCs and ALPCs-FG

2.6 X-射線衍射分析

XRD衍射圖譜主要是由結(jié)晶衍射形成的尖峰與無定形區(qū)域組成的。ALPCs和ALPCs-FG的衍射圖譜如圖8所示。ALPCs的衍射圖譜在2θ=11.500，2θ=290處有兩個強(qiáng)峰，在2θ=20.600和2θ=23.300處有兩個弱峰。ALPCs-FG在2θ=11.600和2θ=29.400處有兩個強(qiáng)峰，在2θ=20.600，2θ=23.100，2θ=27.400和2θ=31.800處出現(xiàn)了四個弱峰，表明經(jīng)過美拉德反應(yīng)后的產(chǎn)物結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。糖基化產(chǎn)物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)越來越趨于無定形結(jié)構(gòu)，這與Li等[22]的研究現(xiàn)象一致。經(jīng)過jade軟件對X射線衍射圖譜進(jìn)一步分析后結(jié)果表明：ALPCs的晶粒尺寸范圍在348～534 nm，而ALPCs-FG的晶粒尺寸范圍在422～537 nm。主要原因可能是蛋白質(zhì)與多糖的糖基化反應(yīng)增加了蛋白質(zhì)聚合鏈的分子流動性，進(jìn)而擾亂了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的排列次序，降低了空間位阻效應(yīng)，導(dǎo)致晶粒尺寸增大[23]從而進(jìn)一步提高復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性。有關(guān)報(bào)道也表明糖基化反應(yīng)可以增加復(fù)合物的晶粒尺寸[24]。

圖8 ALPCs和ALPCs-FG的XRD譜圖Fig.8 XRD spectra of ALPCs and ALPCs-FG

2.7 掃描電鏡分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在一定程度上與蛋白質(zhì)所持有的功能性質(zhì)有著很大的聯(lián)系。用掃描電鏡觀察他們的顆粒特征。如圖9所示，ALPCs是一種無序不規(guī)則的顆粒結(jié)構(gòu)，表面凹凸不平，有空洞現(xiàn)象。當(dāng)與FG發(fā)生糖基化反應(yīng)時，其表面微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，后者結(jié)構(gòu)表面密集程度增加，ALPCs不規(guī)則顆粒的剛性結(jié)構(gòu)消失，形成了表面無定形的顆粒[25]。因此，可以推斷出由于多糖分子(FG)與ALPCs發(fā)生糖基化反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白肽鏈斷裂分子擴(kuò)散，進(jìn)而有利于多糖分子嵌入蛋白空隙中，使得共價復(fù)合物表面更加緊密。有關(guān)研究表明隨著多糖分子的引入增加了乳液的粘度，使得蛋白質(zhì)肽鏈之間的相互作用減弱，空間位阻效應(yīng)降低，表明糖基化反應(yīng)對乳液的乳化性和乳化穩(wěn)定性有明顯的改善作用[26]。

圖9 不同比例尺寸下ALPCs和ALPCs-FG的SEM圖Fig.9 SEM of ALPCs and ALPCs-FG in different scale sizes

3 結(jié)論

本研究通過BOX-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化制備ALPCs-FG共價復(fù)合物，最優(yōu)條件為：pH值為8.0，溫度為90 ℃，反應(yīng)時間為124 min，底物配比[m(紫花苜蓿葉蛋白)∶m(亞麻籽膠)]為1∶1作為最佳反應(yīng)條件時乳化性最好。該條件下產(chǎn)物的乳化性最顯著可達(dá)200.78 m2/g，與未改性的蛋白相比乳化性提高了12.20%。乳化穩(wěn)定性提高了31.83%，最優(yōu)條件下的接枝度達(dá)23.9%。對其ALPCs-FG結(jié)構(gòu)表征分析發(fā)現(xiàn)：紅外圖譜中存在糖環(huán)結(jié)構(gòu)，表明FG成功嫁接在紫花苜蓿葉蛋白上；粒徑分析結(jié)果表明糖基化反應(yīng)使得粒徑增大；X-射線衍射圖譜表明了復(fù)合物晶粒尺寸發(fā)生了變化，說明糖基化反應(yīng)發(fā)生；掃描電鏡結(jié)果表明復(fù)合物表面密集程度增加且結(jié)構(gòu)不定型。綜上分析，糖基化反應(yīng)可以顯著提高ALPCs-FG的乳化性和乳化穩(wěn)定性。