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    新生兒B族鏈球菌ST17型感染的臨床特征和相關(guān)毒力基因檢測

    2021-07-06 10:18:00麥榮嘉李碧婷馬丹娟歐陽凱鄧文喻穆小萍
    關(guān)鍵詞:腦膜炎毒力鏈球菌

    麥榮嘉 李碧婷 馬丹娟 歐陽凱 鄧文喻 穆小萍

    廣東省婦幼保健院,廣州 510010

    B族鏈球菌(group B streptococcus,GBS)是新生兒感染的重要致病菌之一,可見于軟組織感染、菌血癥、肺炎、尿路感染和腦脊液等[1]。GBS所致的新生兒腦膜炎發(fā)病急且病情嚴重、病死率高,部分患兒愈后可出現(xiàn)失明、失聰、智力下降或運動障礙等后遺癥[1-2]。在GBS侵襲性感染臨床分離株中最常見的基因型為ST1、10、17和19,其中ST17型具有較高分離率,并且有較強的致病性[3-4]。近年來,新生兒ST17型GBS感染逐漸引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的重視,但相關(guān)研究資料較少,本研究擬通過收集廣東省婦幼保健院2017至2019年新生兒ST17型GBS感染的臨床特征,探討ST17型的臨床特點與毒力基因的關(guān)系,以便臨床快速診斷和合理運用抗菌藥物。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 以本院2017年1月至2019年9月發(fā)生B族鏈球菌感染的新生兒為研究對象,共27例。納入標準:發(fā)病年齡在0~28 d之間的新生兒;敗血癥或化膿性腦膜炎,診斷標準參照《實用新生兒學(xué)》(第5版)。排除標準:分娩期間的外傷;因手術(shù)后或外傷引起的敗血癥;有遺傳綜合征與重大先天性異常。

    1.2 數(shù)據(jù)收集 對符合納入標準的27例新生兒的臨床資料進行收集整理,包括:標本來源、新生兒出生資料、起病日齡[早發(fā)型敗血癥(early onset sepsis,EOS)和晚發(fā)型敗血癥(late onset sepsis,LOS)]、外周白細胞、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和降鈣素原(PCT)、血培養(yǎng)病原菌的病原鑒定及藥敏結(jié)果、腦脊液常規(guī)和生化檢查、病情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后情況等。

    1.3 研究方法

    1.3.1 GBS培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感試驗 所有操作嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)執(zhí)行。將接種至5%羊血瓊脂平板,35℃,5%CO2培養(yǎng)18~20 h,通過菌落形態(tài)、涂片鏡檢、CAMP試驗進行初篩后,使用MALDI-TOF和VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定GBS,并使用藥敏分析系統(tǒng)對GBS的藥物敏感分析。根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會指南2020版M-100(2020 CLSI M-100)作為藥物敏感性試驗判讀標準。

    1.3.2 血清分型 Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和V 5種乳膠凝集分型血清(Strep-B-Latex?rapid latex agglutination test kit)購自 丹 麥 血 清 研 究 所(Statens serum institute,Hiller?d,Denmark),按其操作步驟及判讀方法進行分型[3]。根據(jù)血清型分組,血清Ⅲ型組和其他型組。

    1.3.3 GBS的多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)參考文獻設(shè)計GBS管家基因引物adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glck和tkt[5],引物由上海生工公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序,應(yīng)用DNAMAN軟件與MLST官網(wǎng)(http://www.mlst.net/)公布的MLST各管家基因的標準序列及型別進行比對分析。

    1.3.3 毒力基因的檢測參考文獻設(shè)計無乳鏈球菌毒力基因(fbsA、ScpB、lmb、hylB)引物[6-9]。引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。

    表1 無乳鏈球菌毒力基因引物

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。符合正態(tài)分布的計量資料組間采用獨立樣本t檢驗,而不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗;計數(shù)資料采用Fisher確切概率法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 一般情況及臨床特征 比較血清Ⅲ型組和其他型組新生兒的臨床資料,性別、出生體質(zhì)量、白細胞計數(shù)、CRP及住院天數(shù),差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);EOS、LOS、PCT、腦脊液葡萄糖以及腦脊液蛋白發(fā)生情況比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);見表2。

    表2 血型Ⅲ組與其他型組感染B族鏈球菌新生兒的臨床資料比較

    2.2 GBS的血清分型 血清Ⅲ型15株(55.6%);其他型組中:Ⅰa型1株(3.7%)、Ⅰb型3株(11.1%)、Ⅱ型5株(18.5%)和Ⅴ型3株(11.1%),見圖1。

    2.3 GBS的MLST分型 本研究對引起新生兒臨床感染的27株GBS進行MLST分型。根據(jù)測序結(jié)果,血清Ⅲ組:ST17型11株、ST19型3株和ST27型1株,其他型組:Ⅰa型有ST103型1株、Ⅰb型有ST12型3株、Ⅱ型有ST10型4株和ST28型1株、Ⅴ型有ST1型3株,見圖1。

    圖1 無乳鏈球菌血清型和MLST型的分布

    2.4 毒力基因檢測 27株無乳鏈球菌均檢出毒力基因scpB和hylB;血清Ⅲ組中ST19和ST27均未檢出fbsA,其他型組GBS檢出率為50.00%(6/12)。lmb在血清Ⅲ組和其他型組的檢出率分別為86.67%(13/15)和83.33%(10/12)。血清Ⅲ組中ST17型(11株)均能檢出fbsA、scpB、lmb、hylB。

    2.5 藥敏試驗 27株GBS菌株對青霉素類(如青霉素、氨芐西林)、頭孢菌素類(頭孢曲松)、萬古霉素和利奈唑胺100.00%敏感。

    2.6 治療和轉(zhuǎn)歸 27例新生兒中有26例治愈或好轉(zhuǎn)出院,1例死亡,屬于血清Ⅲ型組中的ST17型。

    3 討 論

    GBS常定植于女性泌尿生殖道中,在妊娠婦女分離病原菌中分離率高,并且可以通過產(chǎn)道引起新生兒EOS和LOS感染,是國內(nèi)外新生兒面臨的嚴峻問題。盡管美國CDC制定的《圍生期B族鏈球菌疾病預(yù)防指南》以及GBS篩查執(zhí)行在臨床中應(yīng)用使GBS的EOS的感染率明顯下降,但是LOS感染有起病隱匿和癥狀不典型等特點而容易被忽視[10-13]。新生兒感染GBS最常見的疾病表現(xiàn)是重癥肺炎、敗血癥和化膿性腦膜炎,而GBS所致的化膿性腦膜炎主要表現(xiàn)為LOS,其中血清Ⅲ型感染占多數(shù)[1,10]。本研究發(fā)現(xiàn),GBS-LOS以化膿性腦膜炎為主要臨床表現(xiàn),而感染血清Ⅲ型更容易引起腦膜炎的臨床癥狀;血清Ⅲ型感染更具有侵襲性,尤其血清Ⅲ型中的ST17,上述結(jié)果與文獻報道相符。

    GBS的致病性主要取決于其多種毒力因子編碼毒性蛋白的相互作用[1],其中高毒黏附素(hypervirulent adhesin,HvgA)就是一種特殊的上皮細胞壁錨定蛋白。有研究表明,基因型ST17具有的HvgA具有強侵襲功能,與新生兒腦膜炎相關(guān)[1,10]。本研究結(jié)果顯示血清Ⅲ型感染引起的腦膜炎比其他型組高,同時腦脊液的葡萄糖降低以及蛋白的升高的變化明顯比其他型組的多;腦脊液生化變化在血清Ⅲ型中的ST17尤為突出,說明ST17更容易引起新生兒的腦膜炎。除HvgA以外,參與宿主細胞粘附的毒力因子還有fbsA、scpB、lmb等[6-8],而hylB參與透明質(zhì)酸酶的形成[9],而本研究11株ST17均檢出4種毒力基因,這進一步提示ST17具有強侵襲能力。

    根據(jù)2020 CLSIM-100標準,腦脊液分離株不應(yīng)該使用第1、2代頭孢菌素及頭霉素、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類以及氟喹諾酮;由于第3代頭孢菌素類(頭孢曲松或頭孢塞肟)較青霉素類較易穿透血腦屏障并且其低不良反應(yīng)發(fā)生率優(yōu)于萬古霉素,所以針對GBS強毒株感染的新生兒,臨床推薦應(yīng)使用頭孢菌素類進行治療,預(yù)防和治療GBS的化膿性腦膜炎。

    綜上所述,本研究分析了27株GBS在新生兒感染的血清分型分布,其基因型存在差異,ST17占總數(shù)的40.74%;結(jié)合病例的臨床數(shù)據(jù)分析,ST17是導(dǎo)致患兒侵襲性感染的主要基因型,并且與GBS腦膜炎的發(fā)病密切相關(guān)。目前MLST是基于基因水平對多個管家基因核苷酸序列進行細菌基因分型的方法,雖然已應(yīng)用于GBS的遺傳水平研究,但是由于實驗繁瑣并未在臨床鑒定中得到應(yīng)用。建立適用臨床的GBS基因分型,對預(yù)防治療新生兒以及孕婦圍產(chǎn)期的感染是否有積極的意義,有待進一步研究。

    利益沖突:作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。

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