大葉千斤拔黃酮類成分提取及抗氧化活性研究

王 巖 于 璐 高建偉 林 巍 薄力影

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

大葉千斤拔[Flemingiamacrophylla(Willd.)O.Kuntze]又名千斤力、千金紅等[1]，為2015年版中國藥典收載的豆科(Leguminosae)千斤拔屬(Flemingia)植物的一種[2]，廣泛分布于中國熱帶和亞熱帶省區(qū)[3]。千斤拔根具有諸多的藥理作用，常被作為煲湯原料出現(xiàn)在兩廣地區(qū)百姓們?nèi)粘５牟妥馈Ｑ芯勘砻?，千斤拔屬植物中含有黃酮、有機酸和生物堿等多種化學(xué)成分[4-6]，其中黃酮類成分是大葉千斤拔主要成分，尤其以異戊二烯基黃酮含量最多[7]。黃酮類化合物具有廣泛的生理活性，包括抗氧化、抗菌、保肝、抗炎和降血脂等[8-9]。

對大葉千斤拔黃酮類化合物進(jìn)行提取，是開發(fā)其黃酮類化合物的關(guān)鍵步驟。目前研究者[10-11]主要利用有機溶劑如甲醇或乙醇的水溶液進(jìn)行提取。提取方式主要包括回流提取[12]、超聲波輔助提取[13-14]、微波輔助提取[15]和靜態(tài)提取[16]等。超聲波和微波提取利用不同頻率的波，可加速黃酮化合物在溶劑中溶解的速率，但不易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)；靜態(tài)提取效率過低，耗時較長。相比較而言，回流提取工藝既可節(jié)省提取溶劑，同時又在加熱過程中提高了分子熱運動，減少提取時間。因此，試驗擬采用乙醇回流提取大葉千斤拔中的總黃酮，以總黃酮含量為評價指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝條件，并對總黃酮提取物的抗氧化能力進(jìn)行評價，以期為大葉千斤拔黃酮化合物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇、硫酸：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

DPPH：分析純，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

ABTS、氯化銅：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

抗壞血酸：分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠；

新亞銅試劑、TPTZ、氯化鐵：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

過硫酸鉀：分析純，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；

乙酸銨：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鉬酸銨：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；

磷酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

試驗水：超純水；

大葉千斤拔：云南楚雄中藥材經(jīng)銷站。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波清洗器：DL-360E型，上海之信儀器有限公司；

電子分析天平：BSA124S型，賽多利斯有限公司；

紫外可見分光光度儀：752型，上海新茂儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮提取工藝流程

大葉千斤拔根洗凈→烘干(60 ℃)→粉碎→過篩(80目)→乙醇回流提取(70%乙醇，80 ℃)→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→烘箱干燥(50 ℃)→避光保存?zhèn)溆?/p>

1.3.2 總黃酮含量測定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。分別稱取0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配置的溶液，取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液，將其分別置于離心管(10 mL)中，再加入0.3 mL 5% NaNO2后搖勻并靜置6 min，再加入AlCl3(0.3 mL，10%)，靜置6 min，然后加入4.0 mL 10% NaOH，使用70%的乙醇定容至刻線處，靜置15 min，然后在510 nm處測定反應(yīng)液的吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

(2)樣品總黃酮含量測定：取0.5 mL樣品溶液于10 mL 離心管中，加入1 mL 5% NaNO2搖勻，靜置6 min 后加入1 mL 10% AlCl3，搖勻，靜置6 min后加入10 mL 10% NaOH，再用70%乙醇溶液定容到25 mL，搖勻后靜置15 min，然后在510 nm處測定反應(yīng)液的吸光值，空白以乙醇代替提取液。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程計算樣品溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度?？傸S酮含量以蘆丁當(dāng)量表示(μg/mg)。

(1)

式中：

RE——蘆丁當(dāng)量，μg/mg；

50——樣品溶液稀釋倍數(shù)；

C——樣品吸光值代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的蘆丁質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

(1)提取時間：固定料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度40 ℃，考察提取時間(20，40，60，80 min)對總黃酮含量的影響。

(2)料液比：固定提取時間40 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度40 ℃，考察料液比[m大葉千斤拔∶V乙醇分別為1∶4，1∶6，1∶8，1∶10(g/mL)]對總黃酮含量的影響。

(3)乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、提取時間40 min、提取溫度40 ℃，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(60%，70%，80%，90%，100%)對總黃酮含量的影響。

(4)提取溫度：固定料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時間40 min，考察提取溫度(20，40，60，80 ℃)對總黃酮含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取條件 根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定響應(yīng)面試驗的因素水平取值，采用Box-Behnken設(shè)計，以總黃酮含量為響應(yīng)值優(yōu)化大葉千斤拔總黃酮的乙醇回流提取工藝條件。

1.3.5 抗氧化性能測定 將使自由基溶液的初始濃度降低50%的樣品質(zhì)量濃度定義為IC50；而還原力測定和磷鉬法測定中，使吸光值達(dá)到0.500的樣品濃度定義為IC50[17]。

(1)總抗氧化能力：采用磷鉬法[17]。

(2)DPPH自由基清除能力：根據(jù)Kim等[18]的方法。

(3)ABTS+自由基清除能力：根據(jù)Amirouche等[19]的方法。

(4)銅離子還原能力：采用CuPRAC法[20]。

(5)鐵離子還原能力：采用FRAP法[21]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析與處理 所有試驗數(shù)據(jù)均平行測定3次，采用Design-Expert 8.0.6、Statistix 8、Graphpad Prism 7軟件分析所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉千斤拔總黃酮提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定的試驗因素水平見表1。

表1 自變量因素編碼及水平

利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗設(shè)計，試驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。

對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到響應(yīng)值對自變量提取時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度的二次多項回歸模型方程：

表2 乙醇提取大葉千斤拔總黃酮優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果

(2)

表3 回歸模型方差分析?

由圖2可知，料液比不變，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，總黃酮含量呈先升后降趨勢。根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低或過高時不利于黃酮類物質(zhì)游離出來。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)恒定，隨溶劑量的增加總黃酮含量先逐漸增加后趨于穩(wěn)定。這是由于原料中的黃酮類物質(zhì)隨萃取劑的增多基本被完全提取，因此總黃酮含量增加趨勢逐漸變緩。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對總黃酮含量影響的等高線和響應(yīng)曲面圖

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)恒定，隨溫度的升高總黃酮含量逐漸增加后下降。這可能是溫度達(dá)到了乙醇水溶液的沸點，部分溶液揮發(fā)成氣態(tài)降低了提取效果。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對總黃酮含量影響的等高線和響應(yīng)曲面圖

利用Design-Expert 8.0.6軟件解模型方程(2)的逆矩陣，求得總黃酮含量的最大預(yù)測值為76.036 μg/mg，其對應(yīng)的提取工藝組合為提取時間52.148 min，料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6.027(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)70.4%，提取溫度63.56 ℃。為方便驗證，取各參數(shù)的近似值：提取時間52 min，料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度60 ℃，經(jīng)3次實驗驗證，得到總黃酮含量平均值為75.47 μg/mg，相對于預(yù)測值，相對誤差為0.74%，說明該回歸模型優(yōu)化的工藝組合是有效的。

2.2 大葉千斤拔粗提取物的抗氧化能力

以大葉千斤拔粗提物質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，自由基剩余率為縱坐標(biāo)，利用Graphpad Prism 7軟件繪制自由基清除能力的半數(shù)抑制濃度曲線圖，如圖4所示。以大葉千斤拔粗提物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制金屬離子還原能力的擬合線性圖，如圖5所示。

由圖4可知，隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基和ABTS+自由基清除率逐漸上升。由表4可知，大葉千斤拔黃酮提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.212 3，0.044 9 mg/mL。大葉千斤拔乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基具有較強的清除能力，但與維生素C的清除能力還有一定差距。

圖4 大葉千斤拔提取物清除自由基能力

由圖5可知，隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，還原銅離子和鐵離子的能力逐漸增強。由表4可知，大葉千斤拔黃酮提取物對銅離子和鐵離子的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.221 9，0.731 7 mg/mL，對總抗氧化能力的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.389 6 mg/mL。大葉千斤拔乙醇提取物對金屬離子的還原能力與維生素C的相當(dāng)。

圖5 大葉千斤拔提取物金屬離子還原能力與總抗氧化能力

表4 維生素C和大葉千斤拔提取物的抗氧化能力

3 結(jié)論

試驗采用乙醇為提取溶劑，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗設(shè)計方法對大葉千斤拔的總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的提取工藝為提取時間52 min，料液比(m大葉千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度60 ℃，該條件下提取物的總黃酮含量為75.47 μg/mg。對黃酮提取物進(jìn)行抗氧化活性評價，結(jié)果表明大葉千斤拔乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基具有較強的清除能力，但與維生素C的清除能力還有一定差距，而對金屬離子的還原能力與維生素C的相當(dāng)。試驗結(jié)果揭示了大葉千斤拔黃酮類提取物具有較強的體外抗氧化作用，后續(xù)將進(jìn)一步探究其抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性。